鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。     

昆虫抗真菌肽Thanatin基因的合成及原核表达

斑腹刺益蝽 (Podisusmaculiventris)抗真菌肽Thanatin是目前发现的 6种昆虫抗真菌肽之一 ,对真菌具有广谱的免疫诱导杀菌活性 ,由 2 1个氨基酸残基组成 ,对革兰氏阳性和阴性细菌也有一定的杀菌作用。根据已报道的抗真菌肽Thanatin基因的氨基酸序列 ,推导出cDNA序列 ,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略 ,获得大量完整的Thanatin基因片段 ,通过T A克隆法克隆至pGEM TEasy载体 ,进行测序 ,结果证实合成的Thanatin基因与预期设计的完全一致。然后将其亚克隆至表达载体pET 2 1d中。经IPTG诱导表达后 ,采用RNA DNA点杂交和RT PCR检测具Thanatin基因插段的RNA转录表达活性 ,初步结果显示该融合表达产物对烟曲霉菌 (Aspergillusfumigatus)和绿色木霉菌 (Trichodermariricle) 2种病原真菌均有一定的抑菌效果     

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。     

奶牛溶菌酶在大肠杆菌中的分泌表达及抑菌活性研究

为了能在体外获得奶牛溶菌酶(LYZ)并研究其抑菌活性,试验采用人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T并转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE分析和抑菌性检测。重组质粒经PCR、双酶切鉴定结果正确,表达产物经SDS-PAGE检测,分子量约为33 k D,与目标蛋白质一致,且对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌作用。本研究成功构建原核表达载体LYZp ET32T并获得了有抑菌活性的奶牛溶菌酶蛋白。     

猪流行性腹泻病毒变异株M和N双基因的融合表达及免疫原性分析

为了获得具有良好免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株M和N双基因融合蛋白,本研究采用RT-PCR方法分别扩增PEDV变异毒株M、N基因,利用限制性内切酶依次将其定向克隆至pMD18-T载体,将串联的N和M融合基因片段亚克隆至pGEX-KG原核表达载体,构建pGEX-NM双基因重组质粒,转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得了以包涵体表达的N-M双基因融合蛋白,融合蛋白经Western blot检测能够被兔抗PEDV阳性血清识别,将融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,经间接ELISA检测其抗体效价高达1∶12 800以上。本研究获得了具有良好免疫原性的N-M双基因融合蛋白,为M和N蛋白抗原表位鉴定以及结构与功能研究、PEDV变异机制与免疫机制研究、PED新型疫苗和诊断试剂研究奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌(Hp)铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5（MSP5）基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因.将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析.结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp.将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体.将其转化到DH5a宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku.Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别.     

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

昆明抗真菌肽Thanatin基因的合成及原核表达

斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）抗真菌肽Thanatin是目前发现的6种昆虫抗真菌肽之一，对真菌具有广谱的免疫诱导杀菌活性，由21个氨基酸残基组成，对革兰氏阳性和阴性细菌也有一定的杀菌作用。根据已报道的抗真菌肽Thanatin基因的氨基酸序列，推导出cDNA序列，采用基因片段合成结合PCR扩增的策略，获得大量完整的Thanatin基因片段，通过T－A克隆法克隆至pGEM-T Easy载体，进行测序，结果证实合成的Thanatin基因与预期设计的完全一致。然后将其亚克隆至表达载体pET-21d中。经IPTG诱导表达后，采用RNA－DNA点杂交和RT－PCR检测具Thanatin基因插段的RNA转录表达活性，初步结果显示该融合表达产物对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）和绿色木霉菌（Trichoderma riricle）2种病原真菌均有一定的抑菌效果。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ融合蛋白在大肠杆菌中的表达

本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-Buforin Ⅱ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物占菌体总蛋白的35%,经羟胺裂解后对测试菌具有较好的杀菌效果,为进一步的开发与应用打下了基础。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs和Drs-lC在原核中的表达及抗菌活性的初步测定

对黑腹果蝇(Drosophila m elanogaster)抗真菌肽基因Drs和它的同系物基因Drs-lC在pET-21d载体中与T7.Tag标签序列进行了融合表达,并对融合表达产物进行Xa因子切割前后的抗菌活性测定。首先通过长引物PCR获得5′端带有Xa因子识别切割序列的Drs和Drs-lC,分别克隆至pET-21d表达载体上,然后转化E.coliO rigam i(DE3),筛选得到阳性克隆。以IPTG诱导目的基因与载体上的T7.Tag标签序列融合表达,将表达产物进行初步纯化后,以Xa因子进行切割处理,然后测定处理前后样品的抗菌活性。结果显示与T7.Tag标签序列融合表达的D rs、D rs-lC样品和经Xa因子切割后的样品对供试真菌黄色镰刀菌(Fusarium culm orum)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxs-porum)和粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)均有明显的抑制作用。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

传染性支气管炎N基因克隆及在大肠杆菌中的可溶性表达

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。     

犬IFN-γ的原核表达及其对A型流感病毒H3N2亚型的抑制作用

为研究犬的γ干扰素(IFN-γ)对犬流感病毒H3N2亚型的抑制作用,由经ConA诱导过的健康犬淋巴细胞中特异性地扩增犬IFN-γ(cIFN-γ)基因,构建重组原核表达载体pET-cIFN-γ,转化宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以MDCK-VSV法对纯化后产物进行抗病毒活性鉴定,并在MDCK细胞上测定对H3N2亚型犬流感病毒的抑制作用。结果表明,表达产物以包涵体形式存在,经变性、复性、纯化后,所制备犬IFN-γ的抗病毒活性为1.1×10~5 U/mg,重组犬IFN-γ稀释2~6倍后对犬流感病毒的增殖仍具有明显抑制作用。本研究成功表达了具备抗H3N2亚型流感病毒活性的犬IFN-γ,为犬流感病毒新型药物的开发奠定了基础。     

猪源戊型肝炎病毒ORF2部分基因的原核表达及其鉴定

本试验旨在表达猪源戊型肝炎病毒(sHEV)ORF2部分基因片段,纯化表达产物并进行抗原性分析。以sHEV的cDNA为模板,PCR扩增ORF2基因片段,构建重组质粒pET32a-dORF2,转化表达菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting进行检测。试验结果表明,获得60 ku的目的蛋白,该蛋白具有良好的抗原性,主要以可溶性形式存在。     

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。