务川黑牛TLR2基因的单核苷酸多态性(SNP)筛查及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对务川黑牛TLR2基因的单核苷酸多态性(SNP)位点进行筛查,并利用生物信息学软件预测各SNP位点对TLR2基因mRNA和蛋白质结构的影响.结果 表明,务川黑牛TLR2基因共有18个SNP位点,其中有9个位点是错义突变,分别导致相应的氨基酸发生改变.生物信息学分析发现,T978A、...     

康乐黄鸡TLR4基因的多态性分析及其与IL-2水平相关性的分析

为了研究康乐黄鸡Toll样受体4(TLR4)基因的多态性及其与白细胞介素-2(IL-2)水平的相关性,试验选取260只万载康乐黄鸡,翅下静脉采血,全血提取DNA并检测血清中IL-2浓度,对TLR4基因第三外显子区域进行扩增并测序,检测其单核苷酸多态性(SNP)位点,分析康乐黄鸡群体遗传变异情况以及SNP位点与血清中IL-2浓度的相关性。结果表明:所提取的基因组DNA完整,目的基因大小为517 bp,在线比对结果相似度达到了98%,可确定该目的基因为预计的基因片段,并且在TLR4基因的第三外显子处检测到SNP位点(C180T),CC和CT基因型频率显著高于TT基因型(P0.05),该突变位点对康乐黄鸡血清中IL-2浓度有显著影响。说明可将C180T位点作为影响康乐黄鸡免疫指标IL-2的候选SNP位点进行进一步研究。     

康乐黄鸡TLR7基因多态性及血清INF-γ水平相关性研究

为了研究康乐黄鸡TLR7基因多态性以及其与血清γ干扰素(INF-γ)浓度的相关性,试验对300只康乐黄鸡进行翅静脉采血,采用SDS法提取基因组DNA,用PCR法对康乐黄鸡TLR7基因进行扩增和测序,检测其外显子区域的单核苷酸多态性(SNPs),分析康乐黄鸡群体遗传变异情况;同时测定所有试验鸡血清中INF-γ浓度,探索TLR7基因外显子突变对血清中INF-γ浓度的影响。结果表明:提取出的康乐鸡TLRT基因组DNA完整;PCR产物电泳条带清晰,片段大小为190~250 bp,其中TLR7的第二个外显子有一个SNP位点(G-A);测序结果经比对相似率为98%,结果准确;上述SNP突变后的纯合子血清INF-γ浓度显著下降(P0.05)。说明该SNP位点可以作为影响康乐黄鸡免疫指标INF-γ的一个重要的候选突变位点。     

基于测序技术的海南地方猪TLR2基因多态性分析

为了解海南地方猪TLR2基因的多态性,本研究采用PCR法从五指山猪、临高猪和屯昌猪3种海南地方猪的血液中克隆Toll样受体2(TLR2)基因,并进行测序及序列分析。结果显示,3种海南地方猪TLR2基因的扩增长度均为2649bp,编码区长2358bp。3种猪TLR2基因序列的种内比对结果显示,五指山猪种内有7个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;屯昌猪种内有5个核苷酸位点存在多态性,均在编码区外;临高猪种内有4个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。种间比对结果显示3种猪有12个核苷酸位点存在多态性,其中3处为错义突变,导致氨基酸改变。同源性分析结果显示,3种猪的TLR2基因序列高度保守,同源性在99.6%~99.9%之间。蛋白质结构预测分析显示,海南猪TLR2基因在876、1454位点呈现的AG突变均引起了其蛋白质二级结构和三级结构的改变,提示可能存在TLR2功能的变化。本研究填补了海南地方猪TLR2基因多态性空白,为深入研究TLR2基因多态性与猪疫病易感性的关系提供基础研究资料。     

猪TLR2基因Bi-PASA遗传标记的建立及多态性研究

根据人和小鼠TLR2基因序列设计了特异性PCR引物,优化PCR条件后扩增到中国梅山猪、欧洲约克夏猪、PIC-2系及PIC-3系商品猪的TLR2基因690 bp的基因片段,并对其进行序列分析。序列分析结果显示,猪TLR2基因多态性程度低,发现在猪TLR2基因编码区第1 255位点上存在1个单碱基突变位点。利用双向特定等位基因PCR扩增法(B i-PASA)建立了检测猪TLR2基因变异的遗传标记。利用猪TLR2基因的B i-PASA标记,分析了TLR2基因在大河乌猪、撒坝猪和黔邵花猪中的基因频率和多态性。研究建立的B i-PASA遗传标记和基因变异信息,将为进一步分析猪TLR2基因变异与疾病抵抗力及经济性状的相关分析提供基础资料。     

牛TLR4基因生物信息学分析

为了更加深入地了解牛TLR4基因的功能、结构及与该基因有关联的疾病识别及其致病机理,利用牛TLR4基因的氨基酸序列对其编码蛋白的基本理化性质、蛋白质译后的磷酸化位点和糖基化位点以及跨膜结构域和蛋白质结构进行预测。结果显示,牛TLR4基因一共编码841个氨基酸,负电荷残基总和(Asp+Glu)为84,正电荷残基总和(Arg+Lys)为76,不稳定指数小于40,表明该基因编码产物稳定性较好。在该基因整个编码产物中,亲水氨基酸占比较多,平均分值为-0.011,由此得知TLR4基因编码的蛋白质是一种易溶蛋白。有9个潜在的N-糖基化位点;78个磷酸化位点以及存在一个跨膜蛋白和存在信号肽,其切割位点在第25和第26个氨基酸之间。蛋白质的二、三级结构预测结果显示,二级结构和三级结构均由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成,其在生物合成、基因表达与调控等方面有重要作用。本研究结果可为牛TLR4基因深入研究提供理论基础。     

猪Nramp1基因内含子6的SNP多态性分析

本研究以大白猪、长白猪和杜洛克猪为研究对象,通过构建DNA混合池并利用PCR产物直接测序的方法,对Nramp1基因内含子6的SNP多态性进行分析。结果发现,3个猪种在Nramp1基因内含子6中均有4个SNP位点,分别为C~(111)A、C~(225)T、G~(296)T和T~(297)G。基因频率估算结果表明,等位基因C、C、G和T分别是4个SNP位点的优势等位基因。本研究结果可为猪免疫疾病研究和抗病分子育种提供理论基础。     

基于测序技术的海南地方猪TLR4基因多态性分析

为了了解海南地方猪TLR4基因的多态性,试验采用PCR技术对五指山猪、临高猪和屯昌猪的TLR4基因组序列进行了克隆、测序,应用DNAStar和BioEdit软件分析其序列,SMART、SOPMA、SWISS-MODEL在线软件分析TLR4蛋白的结构,并预测二级结构和三级结构。结果表明:获得的三个品种海南地方猪TLR4基因DNA序列全长均为10 435 bp,其中编码区长2 526 bp,编码841个氨基酸。三个品种猪TLR4基因序列种内比对时,五指山猪在种内有1个核苷酸位点存在多态性;屯昌猪在种内有6个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;临高猪在种内有3个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。三个品种猪TLR4基因序列种间比对时,有27个核苷酸位点存在多态性,其中2个为错义突变,导致氨基酸改变。三个品种猪的TLR4基因序列的同源性在99.8%～99.9%之间,高度保守。海南猪TLR4基因在7 209位点的G→T突变和7 781位点的G→A位点突变引起了TLR4蛋白二级结构和三级结构发生改变。说明海南地方猪TLR4基因存在多态性,并且其多态性引起的结构改变可能使TLR4基因功能发生变化。     

用PCR-SSCP方法检测猪Toll样受体4(TLR4)基因外显子3的SNP

Toll样受体(TLRs)能识别各种微生物成分并诱导免疫反应。作为TLR家族中一员的TLR4是识别革兰氏阴性菌内毒素-脂多糖(LPS)的主要受体,其多态性与动物对相关病原的免疫力有着明显的相关性。本文利用PCR-SSCP并结合PCR产物双向测序的方法,对梅山猪、新淮猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪共203个样本TLR4基因外显子3部分片段的单核苷核多态性进行了研究。结果检测到了5个SNP,分别是T611A,G826A,G960A,G962A和C1027A,其中有4个非同义的SNP,有2个SNP的氨基酸性质发生了改变。猪TLR4的SNP出现频率在各猪种中有差异,其中T611A仅在新淮猪和大白猪中检测到,而G826A和C1027A仅分别在新淮猪和大白猪中检测到。     

等位基因特异性PCR技术在绵羊基因SNP分型中的建立

为了在绵羊核基因和线粒体基因中建立简便、快速、准确的SNP分型技术,选择骨形态发生蛋白受体1B基因(BMPR1B)(核基因)A746G突变位点和线粒体基因16S rRNA基因(T1112C)、tRNA-His基因(C11606T)突变位点,对BMPR1B A746G采用三引物等位基因特异性PCR,结果每个样品使用2次扩增即可判定基因型,减少了限制性内切酶的使用。T1112C和C11606T采用四引物等位基因特异性PCR进行分型,T1112C位点检测中,所有样品均能扩增出569 bp最长片段的外引物产物,扩增出349 bp片段的样品为TT野生型,扩增出263 bp片段的样品为CC突变型,没有异质性。C11606T位点检测中,所有样品均能扩增出572 bp最长片段的外引物产物,扩增出408 bp的片段为CC野生型,扩增出213 bp的片段为TT野生型,没有异质性。结果表明四引物等位基因特异性PCR技术可以用于线粒体基因组SNP分型。     

大白猪DQB第2外显子SNP多态性分析

采用混合池DNA扩增产物直接测序技术对大白猪DQB基因第2外显子的SNP多态性进行分析。结果表明,大白猪DQB基因第2外显子有18个SNP位点,表现出高度多态。结果对猪的遗传特性和抗病机制的研究提供了一定的理论依据。     

五指山猪FUT1基因SNP检测及生物信息学分析

为获得五指山猪FUT1基因序列并分析其基因结构,检测FUT1基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点在五指山猪群体中的分布情况,本试验利用PCR扩增猪FUT1基因组序列,通过基因测序寻找该基因中的SNP位点,使用PCR-RFLP方法对120头五指山猪进行了FUT1基因型检测,并运用生物信息学方法对FUT1基因序列进行分析。在猪FUT1基因组中共发现两个单碱基突变,分别位于编码区(A+307G)和3'非翻译区(A+1856C);在FUT1基因A+307G突变位点上,五指山猪均为GG基因型;此外,FUT1基因启动子区域和第2外显子处存在CpG岛。本研究成功获得五指山猪FUT1基因序列信息,为下一步五指山猪FUT1基因的功能研究奠定基础。     

陆川猪瘦素基因的克隆及序列分析

为了研究广西陆川猪瘦素(Leptin)基因编码区序列(CDS)的组成,并为下一步开展Leptin基因表达与陆川猪优质肉质形成的相关性研究提供科学理论依据,试验以11月龄陆川猪背最长肌总RNA为模板,根据Gen Bank中已公布的猪Leptin基因序列(登录号为GQ268936)设计1对PCR引物,利用RT-PCR方法扩增Leptin基因c DNA序列,扩增得到的目的片段经过纯化、连接p MD 18-T载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并测定序列,应用PMP生物分析软件进行蛋白质二级结构预测分析。结果表明:成功克隆获得陆川猪Leptin基因编码区长504 bp,与Gen Bank公布的巴马小型猪的基因同源性为99.2%,与藏猪的基因同源性为99.0%;陆川猪Leptin基因CDS与其他猪种相比,存在第73位点的T→C,碱基C为陆川猪所特有,导致色氨酸突变为精氨酸。由Leptin基因系统进化树构建结果可知,广西陆川猪与藏猪的遗传距离最近,其次是弓头鲸,最远是小鼠;陆川猪Leptin蛋白质二级结构包含有4个α-螺旋和2个β-折叠。说明Leptin基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的主要候选基因之一。     

中国美利奴羊TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在研究Toll样受体2(Toll-like receptor,TLR2)基因的多态性及其与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性的相关性。利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊TLR2基因序列进行比对,选出多态位点丰富的片段进行扩增,运用PCR-SSCP的方法对206个中国美利奴布鲁氏菌病阴性样本和80个中国美利奴羊布鲁氏菌病阳性样本进行TLR2基因的多态性检测,然后对不同等位基因的PCR产物进行测序,确定该基因的多态性位点,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学软件分析RNA二级结构及蛋白质的二级结构。结果表明,在279bp的序列中共检测到3个SNPs,分别为:C1731T、G1737C和G1749T,均未引起对应氨基酸的改变,属于无义突变。这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及基因型频率均不存在显著差异(P0.05)。各突变位点均能引起RNA二级结构和最小自由能的改变,而蛋白质的二级结构均未改变。由此得出,中国美利奴羊TLR2基因的3个SNPs位点(C1731T、G1737C和G1749T)与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析

为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。     

四引物扩增受阻突变体系PCR在绵羊线粒体基因组SNP检测中的应用

为建立绵羊线粒体基因组SNP的四引物扩增受阻突变体系(tetra-primer amplification refractory mutation system,Tetra-primer ARMS)PCR检测方法,选择小尾寒羊线粒体T1112C和C11606T2个SNP,在等位基因特异PCR基础上,根据错配原理设计4条引物,优化PCR反应体系,采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果表明:T1112C位点检测中,所有个体均能扩增出569 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出349 bp片段的个体为野生型,扩增出263 bp片段的个体为突变型。C11606T位点检测中,所有个体均能扩增出572 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出408 bp片段的个体为野生型,扩增出213 bp片段的个体为突变型。在每个线粒体多态位点均检测到野生型和突变型2种基因型,没有发现异质性。应用Tetra-primer ARMS PCR方法,经一次PCR即可判定线粒体SNP位点的基因型,该方法快速、简便,可应用于绵羊线粒体SNP分型。     

苏淮猪IFNGR1基因多态性及其与猪气喘病抗性的相关分析

猪气喘病是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性呼吸道传染病,其流行范围广、难治愈,给养猪业造成了巨大的经济损失。本试验在前期RNA测序结果的基础上,首先选出了差异表达基因干扰素γ受体1(INFGR1),利用PCR扩增和PCR产物直接测序筛查了INFGR1基因外显子区域的SNP位点,进一步在苏淮猪群体开展了基因型分型检测,同时利用实时荧光定量PCR技术检测了苏淮猪群体的猪肺炎支原体感染水平,最后统计分析了INFGR1基因SNP位点不同基因型与苏淮猪群体猪肺炎支原体感染水平的相关。结果发现在苏淮猪IFNGR1基因外显子5上检测到一个SNP(A12557G),苏淮猪群体A等位基因频率为0.555,G等位基因频率为0.445;不同基因型猪肺炎支原体感染量差异极显著(P0.01),GG基因型感染水平显著高于AA基因型,初步推测IFNGR1基因SNP(A12557G)可作为影响苏淮猪气喘病抗性选育潜在的分子遗传标记。     

中国荷斯坦牛Toll样受体4基因的遗传多态性与体细胞评分的关联分析

试验旨在研究中国荷斯坦牛Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因的遗传多态性及其与体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关联性,寻找与乳房炎相关的分子标记,加快中国荷斯坦牛的抗病育种。利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛TLR4基因进行多态性检测,用最小二乘均数法对TLR4基因的多态位点与SCS进行相关分析。结果发现,试验共检测到2个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs),TLR4基因5'侧翼区存在SNP -226 G>C突变,经PCR-RFLP检测发现3种基因型:GG、GC和CC,基因型频率分别为0.208、0.482和0.310;外显子3存在SNP 1760 C>T突变,经PCR-SSCP检测发现3种基因型:CC、TC和TT,基因型频率分别为0.738、0.225和0.007,以上2位点均偏离Hardy-Weinberg 平衡。对于SNP -226 G>C位点,基因型个体的SCS差异不显著;对于SNP 1760 C>T位点,CC基因型个体的SCS最小二乘均值极显著低于TT和TC基因型个体(P<0.01)。SNP 1760 C>T的CC基因型对于中国荷斯坦牛的SCS有较大的遗传效应,可作为分子标记应用于奶牛乳房炎抗性筛选。     

海南五指山猪TLR2基因克隆及生物信息学分析

为了探讨海南五指山猪TLR2基因的分子结构特征及相关遗传变异,为研究TLR2基因遗传变异与免疫疾病的关系打下基础,试验采用PCR技术对该基因组序列进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明:获得2 649 bp的五指山猪TLR2基因的DNA序列,其基因编码区全长2 358 bp,编码785个氨基酸;与Gen Bank中发布的普通猪TLR2基因序列相比,共发现9处突变,其中在编码区序列存在2处突变,属于有义突变;与普通猪、马、牛、绵羊、人、黑猩猩、猕猴、犬、小鼠、鸡、斑马鱼的氨基酸序列的一致性分别为99.7%、82.1%、81.4%、80.6%、78.4%、78.4%、77.8%、77.3%、68.2%、50.7%、40.4%;五指山猪TLR2编码的蛋白主要位于质膜,属于分泌性蛋白、亲水性蛋白和跨膜蛋白,有信号肽和5个糖基化修饰位点,存在较多的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点;不同物种TLR2基因在进化过程中具有较高的保守性。说明TLR2基因可作为今后研究海南五指山猪免疫疾病的重要指标之一。     

柯乐猪PAEP基因多态性及其与繁殖性状的关联分析

【目的】研究孕激素相关子宫内膜蛋白(progestogen associated endometrial protein, PAEP)基因多态性对柯乐猪繁殖性状的影响,以挖掘柯乐猪的高繁殖力基因,用于提升柯乐猪的繁殖力。【方法】以189头经产柯乐猪为试验动物,采用PCR产物测序和序列比对鉴定单核苷酸多态性(SNP)位点,利用SHEsis在线软件分析SNP位点的群体遗传特性,通过RNAfold、SOPMA、SWISS-MODEL和SWISS-PdbViewer程序对SNP位点进行生物信息学分析,利用SPSS 22.0软件分析PAEP基因SNP位点与柯乐猪繁殖性状的相关性。【结果】在柯乐猪PAEP基因中共鉴定到3个SNPs位点：外显子4的g.1884992 T>C位点,为错义突变,导致第135位缬氨酸(V)变成丙氨酸(A);内含子4的g.1885152 G>C和g.1887834 G>A位点。3个突变位点均检测到3种基因型;g.1884992 T>C位点属于低度多态(PIC<0.25),g.1885152 G>C、g.1887834 G>A位点属于...