甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1( )和pBISR1(-).通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1基因导入烟草Ha-vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株.经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状.     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆中表达的初步研究

构建了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，转化大豆，获得转hGM-CSF基因的植株。hGM-CSF的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，该因子末端被加上内质网驻留信号（KDEL），适合在植物中表达。用大豆合丰47的茎尖作为外植体，通过农杆菌介导的转化，获得17株T1转化株。PCR扩增验证转基因植株，检测到11株阳性植株。     

广谱抗病基因chi和hrpZpsta双价表达载体的构建及其在大豆中的遗传转化

大豆的真菌性病害已经成为了限制大豆产量增长及品质提高的主要原因,利用基因工程技术培育出具有广谱性抗病能力的大豆新品种,已成为目前提高大豆抗性的有效途径之一。本研究构建了含2种广谱抗病基因chi和hrp Zpsta的双价植物表达载体,利用农杆菌介导技术导入大豆中,获得了能够在转录水平上表达2种外源抗病性基因的转基因大豆。对经抗性筛选得到的阳性苗及后代植株进行PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR检测,共得到T0代阳性植株7株,T1代阳性植株27株。转化植株的基因组在整合外源基因时出现不同情况,chi-hrp Zpsta双价载体分别以单价和双价两种形式随机整合到受体大豆基因组中并且能稳定遗传,同时在转录水平上亦有不同。     

美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测

研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

白藜芦醇合酶基因对草莓遗传转化的研究

根据已公布的白藜芦醇合酶基因（RS）序列,利用RT-PCR方法从川鄂爬山虎总RNA中获得完整的RS cDNA序列;根据已公布的草莓果实特异性启动子RJ39序列,利用PCR方法从草莓基因组DNA中获得该启动子序列;构建特异性植物表达载体pCAMBIA3300-RJ39-RS-Tnos;在根癌农杆菌介导下,利用叶盘法转化草莓,通过PPT筛选和PCR检测,获得18个转基因株系,对其中7个株系进行Southern印迹杂交鉴定,均杂交出条带。     

Role of LOX3 Gene in Alleviating Adverse Effects of Drought and Pathogens in Rice

Lipoxygenase 3 (LOX3) is a major component of the LOX isozymes in mature rice seeds. To investigate the role of LOX3 gene under stresses, a plant expression vector containing antisense cDNA of LOX3 was constructed. Rice varieties Wuyunjing 7 and Kasalath were transformed by the Agrobacterium-mediated method and transgenic rice plants were generated. PCR and Southern blot results showed that the antisense LOX3 gene was integrated into the rice genome. Analyses of embryo LOX3 deletion and semi-quantitative RT-PCR confirmed the antisense suppression of LOX3 gene in transgenic plants. The T2 antisense plants of LOX3 were sensitive to drought stress, rice blast and bacterial blight compared with non-transgenic plants. These results suggest that the LOX3 gene might function in response to stresses.     

水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫中的作用

LOX3是主要的水稻种胚脂氧合酶同工酶。为了研究水稻LOX3基因在逆境胁迫中的作用,构建了LOX3基因的反义植物表达载体,用农杆菌介导法转化水稻品种武运粳7号和Kasalath,获得了转基因植株。PCR和Southern鉴定证实基因已经导入水稻基因组中,种胚LOX3缺失鉴定和半定量RT PCR分析证实反义RNA抑制了LOX3基因的表达。对T2代转基因植株进行了水分胁迫处理及稻瘟病和白叶枯病的接种鉴定。结果显示,与非转基因对照相比,反义LOX3转基因植株对水分胁迫、稻瘟病和白叶枯病都表现敏感,说明水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫反应中发挥一定的作用。     

大豆GmWRKY35基因的克隆及其增强烟草耐旱能力研究

大豆易遭受干旱、盐、低温等非生物胁迫,严重导致产量下降。利用分子生物学技术提高作物抗性是作物育种的有效途径。锌指蛋白是植物中常见的重要转录因子,能够调控多种胁迫诱导基因的表达,有效提高综合抗性。在这项研究中,利用RT-PCR方法克隆大豆(Glycine max L.)GmWRKY35基因。其cDNA为1 500 bp,编码一个499个氨基酸的蛋白质,预测其分子量为54.89 kD,等电点(p I)为6.74。亚细胞定位分析表明,GmWRKY35定位于细胞核。实时荧光定量PCR分析显示,GmWRKY35转录能被干旱诱导。把GmWRKY35基因通过农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.)中。在干旱胁迫下,与野生型烟草相比,转基因烟草植株表现出主根较长,叶子萎焉少,POD和SOD活性较高,MDA含量和电解质渗漏率较少。主要功能验证表明,GmWRKY35基因在烟草中表达增强了干旱胁迫耐受性。这项研究表明大豆RING-H2型锌指蛋白在植物逆境中有重要作用,同时也为大豆抗性育种提供一个优良的候选基因。     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

可去除选择标记的转CpTI基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI连接,插入根癌农杆菌双T-DNA质粒,构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg;另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体,用以转化农杆菌菌株,再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选,用特异PCR扩增和Southern杂交检测,从分化再生的T0代植株中,鉴定出7个转化CpTI基因的阳性植株。目前,正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定,培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植