贵州岩溶山区多花木蓝根瘤菌及高效菌株筛选

为了筛选获得寄主识别范围广、结瘤固氮能力强的抗逆高效多花木蓝（Indigofera amblyantha）根瘤菌资源,本研究从贵州省22个县（市）5个不同生态功能区采集多花木蓝根瘤样品,经分离、纯化根瘤菌株,观察菌体形态结构,结合16S rRNA基因序列分析比对结果后,选择来自不同地域、不同种类的多花木蓝根瘤菌,采用盆栽回接方法,结合菌株固氮酶活性的测定,筛选结瘤固氮能力强、植物促生效果好的优良根瘤菌株。结果发现：共分离纯化获得33个根瘤菌株,经鉴定分属6属22种。筛选出优良促生固氮根瘤菌6株,其中分离自罗甸县沫阳镇多花木蓝根瘤样品的菌株LMIR32-1为最优促生根瘤菌,其固氮酶活性高达263.05 IU·L^-1,酶活力及植物促生效果与另外5个优良菌株的差异均达显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）水平。本研究结果为豆科牧草共生体系在本地区农牧业生产及生态环境建设中的综合应用提供了理论基础。     

黄腐酸对紫花苜蓿根瘤菌内生定殖及幼苗生长的影响

黄腐酸（Fulvic acid,FA）是一种植物生长调节剂,可促进植物生长。为探索FA对根瘤菌生长、菌株内生定殖及幼苗生长的影响,本试验以3株青色荧光蛋白标记根瘤菌株Rhizobium LH3436f（3436f）、Rhizobium GN5f（gn5f）和Ensifer meliloti 12531f（12531f）为材料,筛选出有利于各标记根瘤菌生长的FA浓度,添加到根瘤菌液中并接种于苜蓿幼苗根系,检测根瘤菌结瘤、苜蓿幼苗生长和菌株内生定殖情况。结果表明：添加适宜浓度FA可显著促进标记根瘤菌侵染根系和在苜蓿体内定殖,12531f根瘤菌添加0.02% FA后接种苜蓿,其在根中的内生定殖数量达到单独接种的11.18倍,差异显著（P<0.05）;根瘤菌添加FA接种可明显促进苜蓿结瘤和生长,效果最佳的是3436f添加0.01% FA接种;根瘤菌添加FA接种也使苜蓿叶绿素含量显著提高,gn5f添加0.02% FA时苜蓿叶片叶绿素含量最高,显著高出WCK 111.41%（P<0.05）。因此,FA可促进根瘤菌在苜蓿幼苗内的定殖,二者可协同促进苜蓿幼苗生长。     

苜蓿根瘤菌cfp荧光标记株的构建及筛选方法

荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Escherichia coli pRK2073,受体菌苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 12531和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5,及cfp青色荧光基因供体菌E.coli pMP45179为供试菌株,以三亲本杂交法进行结合转导,并以无氮培养基和TY培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测,再对初选菌株以甘农5号紫花苜蓿为宿主进行回接验证,测定了回接植株的生物量,结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明,1)三亲本杂交转导法适用于苜蓿根瘤菌cfp标记菌株的构建,获得大量S.meliloti 12531和R.meliloti GN5的荧光标记株;2)经逐层筛选获得的荧光标记菌中,S.meliloti 12531-cfp6和R.meliloti GNf-cfp5遗传稳定性好,荧光表达量高,结瘤促生能力强;3)与现有抗生素平板分离筛选相比,无氮培养基结合耐药平板筛选能显著提高荧光标记根瘤菌株的甄别筛选效率;4)三亲本杂交法获得的苜蓿根瘤菌荧光标记株个体间差异较大,对标记株固氮及荧光表达能力遗传稳定性的验证和对宿主植物的结瘤促生能力的检测是cfp荧光标记根瘤菌筛选的必要手段。     

高寒草地耐低温植物根际促生菌的筛选鉴定及特性研究

为获得优良植物根际促生菌（PGPR）并明确其促生特性,以红原地区广泛分布的3种高寒草地优势植物为材料,采用选择性培养基从3种高寒植物根际分离、筛选具有固氮、溶磷、分泌植物激素能力的耐低温植物根际促生菌,并进行16S rRNA分子生物学鉴定。结果表明：毛稃羊茅、洽草、紫穗鹅观草植物根际分布着大量根际细菌,且PGPR在根际不同部位的数量呈现出根系表面（RP）>根表土壤（RS）>根内（HP）的分布规律。经筛选共获得76株PGPR菌株,其中固氮菌30株,其固氮酶活性为124.61~311.04 nmol C₂H₄·h^-1·mL^-1;溶解无机磷菌株24株,溶解有机磷菌株22株,溶磷量分别为249.85~558.07 μg·mL^-1和52.25~158.77 μg·mL^-1。挑选固氮酶活性较高、溶磷能力较强的27株PGPR菌株进行分泌植物激素能力测定,26株菌株具有分泌赤霉素（GA₃）的能力,分泌量为0.60~52.91 μg·mL^-1,分泌吲哚-3-乙酸（IAA）菌株18株,分泌量为0.11~1.53 μg·mL^-1,分泌玉米素（t-Z）含量均小于0.31 μg·mL^-1。筛选出综合性能优良的菌株14株,经鉴定分别属于假单胞菌属、不动杆菌属、假节杆菌属、贪噬菌属。研究结果可为研制适合高寒地区植被恢复的微生物肥料提供宝贵的菌种资源及理论基础。     

贵州尾矿区野生豆科牧草根瘤菌及其抗性测定

为了筛选获得对复合重金属具有耐受能力且能在本地豆科植物根系内定殖共生的抗性根瘤菌,本研究从贵州省内的锰矿区、铅锌矿区采集野生豆科牧草根瘤样品,经分离纯化、菌体形态观察、16S rRNA基因序列比对分析,获得71个根瘤菌保存菌株。系统发育和区系分析结果表明,分离菌株分属7属28种,其中根瘤菌属(Rhizobium)的分布频率高达54.93%,为优势属,木兰根瘤菌(R.indigoferae)的分布频率最高(15.49%),为优势种。选择来自不同尾矿区、不同种类的根瘤菌17株,采用重金属平板法测定各供试菌株对贵州尾矿土分布较多的Pb²⁺,Zn²⁺,Cr⁶⁺,Mn²⁺,Cd²⁺五种重金属的耐受性,结果发现17个菌株对3种或3种以上的重金属都具有不同程度的耐受能力,其中HMZT039-6,HSST042-6,HSST042-1,ZHQT052-1和HXTT050-1对5种重金属离子均有耐受能力,为筛选出的最优抗性根瘤菌株。本研究结果可为本地区土壤重金属污染的修复治理提供共生微生物资源。     

黄芪根际促生菌(PGPR)筛选与特性研究

为获得黄芪根际PGPR菌株并明确其促生特性,可为其在生产中的应用提供依据,本研究以黄芪的根瘤、根系及根际土壤为材料,利用选择性培养基分离筛选根瘤菌与溶磷菌,测定根瘤菌固氮酶活性、溶磷菌株的溶磷能力及分泌3-吲哚乙酸(IAA)的能力,从中筛选出综合性能优良的菌株,并运用生理生化鉴定和16S rDNA分子生物学鉴定相结合的方法鉴定优良菌株的种属。结果发现,溶磷菌数量的分布具有根系表面(RP)>根表土壤(RS)>远根土(NRS)>根内(HP)的规律,有明显的根际效应;经分离纯化获得76 株PGPR菌,其中根瘤菌1株、溶解无机磷菌株42 株和溶解有机磷菌株33 株,其中可分泌IAA能力的溶磷菌株有7株;筛选出综合性能优良,有进一步开发应用潜力的溶磷菌株7株,根瘤菌1株,经鉴定溶磷菌中3株为Pseudomonas sp.,3株为Bacillus sp.和1株为Klebsiella oxytoca,根瘤菌为Rhizobium sp.,这为研制生物菌肥提供优良菌种,同时丰富优良根际促生菌资源库。     

黑土区紫花苜蓿根瘤菌特性研究与促生能力分析

本文通过采集东北黑土地区2龄紫花苜蓿(Medicago)根瘤菌菌株,经过根瘤菌的耐盐、耐碱、耐酸、溶磷能力、生长素分泌能力、代时、固氮酶活性等生物学特性测试;并进行回接试验,测定供试菌株促生植株的根瘤数、根瘤重、生物量及全氮量,旨在阐明黑土区苜蓿根瘤菌特性与促生植株地上生物量及其全氮的关系。结果表明:菌株促生植株的全氮量与根瘤菌泌酸能力、代时、促生植株根瘤数显著相关(P≤0.05);菌株促生植株地上生物量与菌株溶磷能力、泌酸能力、促生植株根瘤重呈极显著相关(P≤0.01)。通过通径分和回归分析建立了苜蓿根瘤菌株促生植株地上生物量及其全氮量的最优多元线性回归方程,该方程可为优异菌株筛选及其促生能力判断提供科学依据。     

3种荒漠珍稀植物根际促生菌的筛选、鉴定及对高粱幼苗生长的影响

为获得优良植物根际促生菌,本研究从荒漠珍稀植物根际土中分离筛选促生菌,结合16S rDNA基因序列、生理生化特征对其进行鉴定,并通过发芽和盆栽试验分析其促生效果。结果显示：土壤全氮、有效钾、有机质含量较少,呈弱碱性;分离得到5株可固氮、溶磷、产蛋白酶的菌株BN5,HN7,BP4,HD3及SD5,其分别隶属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）、根癌农杆菌属（Agrobacterium tumefaciens）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、磷酸镰孢菌属（Fictibacillus phosphorivorans）及单纯芽孢杆菌属（Bacillus simplex）;5株菌对高粱（Sorghum bicolor）幼苗均表现出促生作用,效果最明显的为菌株BP4,其处理的高粱幼苗发芽势、发芽率、芽长、根长、株高及鲜重较对照组分别增加了55.30%,23.16%,54.52%,40.24%,22.59%,26.67%。本研究结果可为今后荒漠优良菌种资源库的建设提供理论依据。     

楚雄南苜蓿根瘤菌的鉴定及其耐酸耐铝特性研究

为了获得耐酸铝性强的楚雄南苜蓿(Medicago polymorpha L.)共生根瘤菌菌株,本研究对从不同地区采集到的5份根瘤样品进行分离、纯化和鉴定。对鉴定得到的根瘤菌进行菌体形态观察、低氮回接以及耐酸、铝特性的研究。结果表明：YS-8,YS-10,DH-9,DH-31属于根瘤菌属根瘤菌、CX-44属于中华根瘤菌属苜蓿中华根瘤菌,5个菌株均符合根瘤菌基本形态特征。接种5株根瘤菌后,楚雄南苜蓿的干重、鲜重、株高、结瘤数均显著高于对照(P<0.05);pH值在4.5～7.5范围内,5株菌株均能正常生长,当pH值=3.5时,5株菌株全部死亡;当Al³⁺浓度在100～1 500 mg·L^-1之间,随着Al³⁺浓度的升高,菌株生长逐渐缓慢,Al³⁺浓度达到2 000 mg·L^-1时,5株菌株全部死亡。分离出的5株根瘤菌均能与楚雄南苜蓿共生结瘤并促进其生长,且具有较强的耐酸铝性。筛选出的5株根瘤菌均能在pH值大于3.5且铝离子浓度(pH值=5)小于1 500 mg·L^-...     

大米草中耐盐乳酸菌的分离鉴定及对大米草青贮品质的影响

本试验旨在研究大米草（Spartina anglica Hubb.）中耐盐乳酸菌的分离鉴定及对大米草青贮品质的影响，以期为大米草青贮利用提供技术支持和理论依据。试验采用传统培养法筛选出耐盐浓度为10%的乳酸菌菌株，通过生理生化及16S rDNA序列分析法综合鉴定筛选的菌株，并将其添加到大米草原料中进行青贮效果观察。结果表明：分离获得的42株乳酸菌菌株，耐盐溶度最高为10%的4株乳酸菌均为同型发酵的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），命名为C1、C2、C3和C4。4株乳酸菌均能提高大米草的青贮发酵品质，其中C4显著提高青贮料的可溶性碳水化合物和粗脂肪含量（P<0.05），显著降低青贮料的氨态氮含量（P<0.05）；另外，C4处理组的干物质含量和乳酸含量显著高于其他3个菌株处理组（P<0.05），中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和丁酸含量显著（P<0.05）低于其他3个菌株处理组，青贮效果最佳。     

铝和酸胁迫对苜蓿根瘤菌生长和抗氧化酶系的影响

在铝和酸胁迫下,比较分析了天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌的生长及SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、POD(过氧化物酶)、及GR(谷胱甘肽还原酶) 等抗氧化酶系响应特点。铝胁迫设5个梯度,即0,25,50,75,100 μmol/L;酸胁迫设4个pH水平,即4,5,6,7。结果表明,铝和酸胁迫下,2种苜蓿根瘤菌的OD_A600均显著降低,生长受到抑制,且天蓝苜蓿根瘤菌的OD_A600显著高于紫花苜蓿根瘤菌。在pH水平为4和5时,紫花苜蓿根瘤菌没有生长。在铝毒胁迫下,天蓝苜蓿根瘤菌的SOD酶活性一定程度减小后缓慢上升,而CAT、POD和GR酶活性随铝浓度增大显著下降;紫花苜蓿根瘤菌的SOD,CAT及GR酶活在低Al胁迫下无显著变化,在高铝胁迫下显著下降。随着pH水平的下降,天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌均表现为SOD、CAT、POD、GR酶活性的显著下降。在不同铝及酸胁迫下,天蓝苜蓿根瘤菌各抗氧化酶活性显著高于紫花苜蓿根瘤菌。综合分析认为天蓝苜蓿根瘤菌较之紫花苜蓿根瘤菌有较强的耐酸、耐铝性。     

禾本科草坪草混播天蓝苜蓿、小苜蓿的效果研究

利用综合评定分析的方法评价匍匐型天蓝苜蓿（Medicago minima L.）、小苜蓿（Medicago lupulina L.）与禾本科草坪草（草地早熟禾（Poa pratensis L.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.））混播后绿地草坪的品质;同时研究它们的植株生长和根系分布,探讨豆禾混播对禾本科草坪景观的影响。结果表明：天蓝苜蓿、小苜蓿与禾本科草坪草混播可以促进禾本科草坪草生长,豆禾混播草坪性能优于禾禾混播,其中天蓝苜蓿与这两种禾本科草坪草混播效果佳,可形成致密、颜色均一的绿地草坪;在叶色上,天蓝苜蓿适合与叶片颜色较深的禾本科草坪草混播,而小苜蓿则适合与叶片颜色较浅的禾本科草坪草混播;混播草坪中豆科根系分布较深,禾本科根系分布较浅,豆禾混播可利用不同土层的营养物质;两种豆科植物较适宜的播量均为2 g·m^-2,与禾本科草坪草混播最佳的播种时间为秋季。综合分析认为,天蓝苜蓿、小苜蓿与禾本科草坪草混播可以建造优质、美观的绿地草坪。     

耐盐促生菌筛选鉴定及对盐胁迫燕麦生长的影响

为获得耐盐促生菌资源,探究对盐胁迫燕麦（Avena sativa L.）的促生作用。用选择性功能培养基复筛黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）根系的促生菌,16S rDNA分子生物学技术确定分类学地位。测定接种促生菌对燕麦根系形态、株高及地上生物量的影响。获得目标菌株2株,LrM1固氮酶活性117.0 nmol C₂H₄·h^-1·mL^-1,溶无机磷量40.0 mg·L^-1,分泌indole-3-acetic acid （IAA） 30.0 μg·mL^-1,无产1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC）脱氨酶特性,耐盐性为9%,经鉴定为Paenibacillus peoriae;LrM2固氮酶活性280.0 nmol C₂H₄·h^-1·mL^-1,溶无机磷量5.6 mg·L^-1,具有产ACC脱氨酶的特性,耐盐性达11%,经鉴定为Bacillus属。不同盐浓度下各促生菌对燕麦的促生效果差异显著（P<0.05）,LrM2在0.6% NaCl胁迫时显著促进总根长、根表面积、根体积和根尖数增加,株高和鲜重分别增加21.9%和24.7%（P<0.05）。LrM2有多种促生特性和高耐盐性,能够促进盐胁迫下燕麦的生长,具有开发成盐碱地微生物肥料的潜力。     

钙磷对酸铝胁迫后紫花苜蓿-根瘤菌体系结瘤固氮的修复效应

本试验采用水培法,以三得利紫花苜蓿和耐酸苜蓿根瘤菌91522为材料,探讨了酸铝胁迫处理苜蓿幼苗1周后,施加Ca²⁺、P对紫花苜蓿-根瘤菌结瘤固氮性能和群体感应的修复/恢复作用。结果表明,酸铝毒害后,Ca²⁺对紫花苜蓿-根瘤菌结瘤过程有显著的修复效应,根瘤菌群体感应、根瘤固氮酶活性显著提高;4 μmol/L P素营养与Ca²⁺存在交互效应,导致苜蓿现瘤时间较未经修复的处理提前14 d,苜蓿结瘤总数提高了247.09%,结瘤率达到90%,根毛变形率由3.33%提高到28.89%。Ca²⁺对结瘤动力学曲线的修复作用主要表现为从开始结瘤起同期结瘤数显著提高。P素对结瘤数影响在Ca²⁺ 5 mmol/L条件下较显著;Ca²⁺对固氮酶活性有显著提高作用,而且5 mmol/L效果优于10 mmol/L,4 μmol/L P素可以进一步提高固氮酶活性。初步认为,补充Ca²⁺和4 μmol/L P可以促进根瘤菌在酸铝胁迫条件下群体感应物的分泌、改善苜蓿根毛对结瘤信号的感知和变形,修复酸铝对苜蓿和根瘤菌的毒害,恢复和提高固氮性能。     

轮作豆科牧草对连作马铃薯田土壤微生物菌群及酶活性的影响

本试验研究了轮作不同种类豆科牧草对连作马铃薯田土壤微生物菌群、数量分布及酶活性的影响。结果表明,通过轮作箭筈豌豆、天蓝苜蓿和陇东苜蓿3种豆科牧草,对连作马铃薯田土壤可培养细菌和真菌数量分布,微生物活性,土壤脲酶活性,碱性磷酸酶活性及过氧化氢酶活性均有明显的促进作用,与种植牧草前相比,轮作牧草后土壤中真菌/细菌最高可降低50.72%,说明真菌数量下降,通过轮作不同连作年限马铃薯田土壤微生物菌群从真菌型向细菌型转化;与种植牧草前相比好气型固氮菌数量最高增加283.69%;脲酶活性最高增加6.4倍;碱性磷酸酶活性和过氧化氢酶活性均显著提高。但是对连作土壤的改良作用高低还与豆科牧草种类及土壤连作年限有关,不同连作年限的土壤对不同种类的豆科牧草表现出不同的敏感性。     

根瘤菌对紫花苜蓿生物修复镉污染功能的影响

为研究根瘤菌对紫花苜蓿修复镉污染土壤的作用，本试验在低氮素（1 mmol·L^-1）和高氮素（4 mmol·L^-1）水平下对接种和不接种根瘤菌的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）进行镉（CdCl₂）胁迫处理，测定处理后的株高、生物量、地上部和地下部镉含量、氮含量、叶片叶绿素和丙二醛含量。结果表明：在Cd胁迫下，提高氮素水平可显著增加植物株高和生物量、叶片叶绿素含量和Cd含量（P<0.05）；接种根瘤菌可提高紫花苜蓿氮素含量，增加植物的株高、生物量、叶片叶绿素含量和Cd含量，降低丙二醛含量（P<0.05）。综上所述，根瘤通过增加氮素含量缓解重金属Cd的毒害，并促进紫花苜蓿对Cd的吸收，表明根瘤菌在Cd污染土壤的修复中具有较大潜力和广阔的应用前景。     

免耕补播对冀西北坝上地区草原植被群落特征的影响

为探究免耕补播对冀西北坝上地区草原植被群落特征的影响,本试验在国家牧草产业技术体系张家口综合试验站以中度退化草地为对象,设置补播紫花苜蓿（Medicago sativa）+冰草（Agropyron cristatum）+施肥（MAF）、紫花苜蓿+冰草（MA）、紫花苜蓿单播（M）、紫花苜蓿+披碱草（Elymus nutans）+施肥（MEF）、紫花苜蓿+披碱草（ME）、披碱草单播（E）、冰草单播（A）、不补播（CK）8个处理。测定其地上生物量、植被盖度、群落多样性等指标,结果表明,紫花苜蓿+冰草+施肥处理使地上生物量与盖度显著提高（P<0.05）;该处理下提高了禾本科植物在群落中的重要值（P<0.05）,丰富度指数、多样性指数显著增加（P<0.05）。因此,紫花苜蓿+冰草+施肥处理的补播效果最好。     

不同牧草混播对退化高寒草甸土壤养分及生物量的影响

适宜的牧草混播对于改善退化高寒草甸及高寒地区畜牧业现状具有重要的现实意义,但不同牧草混播条件下退化高寒草甸土壤养分及生物量变化特征尚不明确。为此,本研究以垂穗披碱草（Elymus nutans）、早熟禾（Poa pratensis）、呼伦贝尔苜蓿（Medicago falcata）为试验草种,在三江源区重度退化高寒草甸开展为期3年的混播试验,探讨不同牧草混播对退化高寒草甸土壤养分及生物量的影响。结果表明：不同牧草混播条件下,草甸土壤有机碳含量与全氮及不同形态氮素含量呈显著正相关（P<0.05）;草甸土壤养分含量发生显著变化（P<0.05）,EM（垂穗披碱草+呼伦贝尔苜蓿）混播的土壤养分状况最佳;草甸地上、地下生物量显著增加（P<0.05）,EM混播的效果最为显著（P<0.05）。综上,在重度退化高寒草甸恢复过程中,如采取人工草地建植手段,建议选择EM混播。