黑杨三倍体 PtSIP3基因的克隆与功能分析

本研究以黑杨中林46三倍体为材料,依据前期表达谱芯片的分析结果,分离克隆得到三倍体材料中高表达基因PtSIP3,该基因的编码产物为钙调磷酸酶B(Calcineurin B-like Proteins,简称CBL)的靶蛋白。随后构建了双元表达载体pRI101-PtSIP3,并成功的转入拟南芥中。经qRT-PCR表达分析和表型观察,发现PtSIP3 在拟南芥中异源过表达会抑制胚和果荚的发育、促进根的快速伸长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。     

日本落叶松杂种及亲本 4CL基因的克隆和SNP多态性分析

以日本落叶松(Larix kaempferi)不同杂交组合为材料,依据转录组测序信息,成功获得了11种日本落叶松材料的4 CL基因的编码区序列,该序列长1 537 bp,包含完整ORF片段1 368 bp,编码455个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明,除日本落叶松Larix16×Larix61组合外,Larix82×Larix13、Larix40×Larix10和Larix82×Larix61子代的表达均高于双亲,推测4 CL基因差异表达与落叶松杂种的木质素生物合成有关。进一步采用SNP标记方法和DNAMAN软件对不同日本落叶松杂种和亲本组合的单核苷酸多态性进行分析。共检测到66个SNP多态性位点,表明日本落叶松4CL 具有丰富的遗传多样性。66个SNP变异中,属于三突变1个;转换类型45个,占总变异的68.18%;20个属于颠换类型,占总变异的30.30%,转换:颠换=9:4。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占28.79%和39.39%;颠换类型中A/C、A/T、G/C、G/T分别占4.55%、9.09%、9.09%和7.58%。采用NJ 聚类法对克隆片段的氨基酸序列进行了遗传多样性分析。     

毛竹木质素合成相关基因C4H的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中克隆了C4H基因cDNA全长序列。该基因包含1 506 bp开放读码框,编码502个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中序列进行比对, 结果表明该基因与单子叶植物高粱、水稻和玉米中的C4H基因同源性较高,分别达到88%、88%和87%。经过荧光定量PCR分析,该基因在毛竹不同发育时期和不同组织中表达丰度不同,在冬笋中表达量最高,其次为春笋顶部、中部、叶、3年生茎、根、叶鞘、2年生茎、春笋、1年生茎,而在春笋基部中表达最低。在笋顶部、中部的高水平表达表明本文克隆的C4H基因与发育时期维管组织的细胞壁加厚相关,可以作为调控木质素合成的目标基因用于竹子基因工程改良。     

白蜡虫热激蛋白基因在低温胁迫下的表达分析

白蜡虫对低温的高度耐受性对其生存、繁殖及白蜡生产都至关重要。为探讨低温胁迫对白蜡虫hsp表达的影响,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）,对白蜡虫二龄雄虫在低温胁迫下7个不同的 hsps（hsp21.5,hsp21.7,hsp40,hsp60,hsp70,hsc70,hsp90）的基因表达情况进行了检测。结果发现,除hsc70外,其余hsps均能被低温不同程度地诱导,其中hsp70、hsp21.7和hsp90的上调量十分显著。说明多数hsps都与白蜡虫幼虫应对低温胁迫相关。     

miR396在落叶松体细胞胚胎中的功能研究

[目的]探讨miR396在落叶松体细胞胚胎发生中的功能.以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视角,同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫.[方法]构建pre-miR396超表达载体,通过农杆菌介导侵染,将pre-miR396转入落叶松胚性细胞中,筛选稳定抗性细胞系.在DNA与RNA水平上,对抗性细胞系进行的鉴定、检测,同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异.[结果]在抗性细胞系基因组中,扩增出HTP与miR396的特异性片段,且无农杆菌Virg基因片段.RNA表达水平上,抗性系pre-miR396与miR396表达皆增加,而靶基因LaGRFs的表达量下调.统计表明抗性系胚的发芽率、生根率、叶片数目畸形率分别为70.60%、0.60%、37%,而野生型分别为92.50%、10.55%、4%,抗性系胚的发芽率、生根率显著降低(Sig.=0.000),叶片数目畸形率显著增加(Sig.=0.000).[结论]miR396在落叶松体细胞胚胎发生过程中,可能通过负调节靶基因LaGRFs的表达或者通过LaGRFs影响与它相互作用的基因,参与体胚子叶原基细胞代谢,从而影响了子叶与叶片的发育;通过负调节LaGRFs或者其它与根部发育相关的靶基因,影响了根端分生区细胞的活动,参与调控根的发育.     

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C₃型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。     

杜仲1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA全长克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出DXR基因cDNA全长。序列分析结果表明该基因序列全长1 814 bp,共编码478个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.71 kD,理论等电点5.79,命名为EuDXR。推导的EuDXR蛋白质序列具有植物DXR酶的5个典型基序,并预测出26个潜在的功能位点。系统进化树分析表明EuDXR蛋白与玉米、水稻亲缘关系最近,其次为橡胶、拟南芥、烟草。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

黑杨DNA甲基转移酶基因片段的分离及表达分析

利用同源序列克隆技术,分离了三倍体黑杨中4类(MET、CMT、DRM、DNMT2)8个特异甲基转移酶片段,其中,5个片段与二倍体同源性达到100%,3个片段发生了剪切变化。通过实时定量PCR技术检测8个甲基转移酶在不同倍性、不同部位、不同生长时期间表达模式的差异,通过对5个不同部位基因表达的检测,表明不同倍性黑杨在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控。通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况,发现随着时间的推移,MET家族 (PnD1和PnD2) 基因可能是拮抗调节,CMT (PnD3和PnD4) 家族基因可能是协同调节;而隶属于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表达都比较弱,唯独三倍体茎尖有很高的表达。由于茎尖是生长旺盛的部位,PnD6有可能是影响三倍体速生的重要基因。这些结果可能暗示,DNA甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程。     

根癌农杆菌介导的反义VeFAD2基因对少根根霉的遗传转化及其影响因子

Agrobacteriurn tumefaciens-mediated transformation (AtMT) method was used to study the genetic transformation in Rhizopus arrhizus of antisense expression vector pBI121-fad2 of VeFAD₂ gene. We studied the key factors influencing transformation, such as A.tumefaciens strains,bacterial cell volume initially used, co-cultivation time, effective period and concentration of AS. The results shows that the ideal A.tumefaciens strain is AGL-1, the optimum bacterial cell volume initially used is 50-100 μL and co-culture 24 hours will get the most transformants. At co-culture period, AS induction is indispensable. It is beneficial to improve transformation ratio by adding to 200 μmol·L^-1 AS at preincubate period and increasing AS concentration to 400-600 μmol·L^-1 at co-culture period. It determined that antisense VeFAD₂ gene has been integrated into the genome of R. arrhizus by PCR-Southern detection.     

落叶松胚性细胞系分化能力及染色体变异的研究

以落叶松未成熟合子胚诱导的16个胚性细胞系为材料,对继代培养的细胞系间及不同世代间染色体数目和体细胞胚胎发生率进行对比研究,结果表明:落叶松胚性细胞系随继代培养时间的增加,总体体细胞胚分化能力逐渐下降,平均体细胞胚分化率从继代培养第7次后的335.6个·g ^-1降低到第22次后的268.2个·g^-1,细胞染色体数目变异率逐步增加,从5.4%上升到40.0%;不同细胞系间体细胞胚分化能力及稳定性差异明显,分化能力较高的细胞系染色体数目变异几率相应较小,在继代培养第25次后,细胞系a214染色体数目变异率为0%,体细胞胚分化率为416.1个·g ^-1。     

华北落叶松胚性愈伤组织诱导影响因子的研究

以成熟合子胚为外植体,用完全随机、正交设计等试验方法加之组培技术来研究影响华北落叶松(Larix princi-pis-rupprechtii)胚性愈伤组织诱导的几种主要因子。结果表明:诱导胚性愈伤组织过程中的最佳灭菌方式为2%Na-ClO灭菌30 min,剥皮、去胚乳处理。其中污染率和NaClO的灭菌时间呈负相关:NaClO灭菌时间越长,污染率越低。诱导胚性愈伤组织的最佳琼脂浓度为4 g·L-1,且过高和过低的琼脂浓度不仅降低了其诱导率,提高了愈伤组织的褐化水平,也影响了外植体的发育形态。外源激素的正交试验结果表明:2,4-D是主要影响因子,对诱导率的影响显著,其次是KT,最后是6-BA。最佳的植物外源激素配比是2,4-D 1.8 mg·L-1+6-BA 0.3 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1。     

云杉属树种体细胞胚胎发生研究进展

云杉属树种具有适应性强、抗逆性强、生长迅速等特性,是园林绿化的重要树种。体细胞胚胎发生技术在云杉属树种中的应用,为其品种改良和规模化、产业化繁殖提供了可能。文中综述云杉属树种体细胞胚胎发生的过程及主要影响因素,提出在云杉属树种体细胞胚胎诱导过程中存在的问题和研究展望,以期为云杉属树种体细胞胚产量和质量的提高以及建立高效再生体系提供借鉴。     

Somatic embryogenesis inCephalotaxus harringtonia embryo-megagametophyte co-culture

Somatic embryogenesis was initiated fromCephalotaxus harringtonia (Forbes) K. Koch embryo culture. Explants consisted of embryo and megagametophyte halves both cut longitudinally. They were removed aseptically from mature seeds and grown together on a solid Murashige and Skoog modified medium supplemented with 5 mg·l ⁻¹ 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Embryogenic cultures started from callus after three or more months on the primary medium. The embryogenic callus originated from the suspensor region of the embryo. All chromosome counts made in the cells of the embryonic structures demonstrated a diploid stage, which suggest that they originated from zygotic embryo tissue. The early stages of somatic embryogenic development were achieved,i.e., formation of small clusters consisting of an embryonal region made up of isodiametric meristematic cells. A more advanced stage was reached in some cultures in which the distal embryonal end of the embryo appeared smooth and opaque. The ultrastructural characteristics of the embryos, the two types of embryo cells, embryonal and suspensor cells, as well as their contents were similar to those already reported in the case of somatic embryogenesis of other conifers.     

落叶松实时定量PCR内参基因的筛选

本研究针对日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的31份材料,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,分析了12个持家基因(ACT 4、APm、Chc、Gapc、RPL1、RPL2、EF1、EF2、eIF、E3UL、UBQ和UPL2) 在这31份材料中的表达情况。经geNorm和NormFinder两种分析软件对这12个持家基因进行表达稳定性分析,结果表明:APm在不同器官、体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定;EF1 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定;eIF在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定。分析结果表明,针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基因做内参基因使用。进行基因表达细微差异研究时,可根据需要使用2个或2个以上内参组合。     

马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同器官间显著下调表达的时间点存在差异;同时,不同器官pmCaM表达量变化均存在特异的随时间发展的波动特征,其中发现,根茎pmCaM在松材线虫接种45 min时均处于表达量高峰。本研究结果显示pmCaM表达响应了松材线虫侵染,揭示pmCaM可能参与了调控松材线虫-马尾松互作早期的钙信号响应。     

落叶松体胚发育中12个针叶树特异microRNAs表达分析

以落叶松体细胞胚胎发育8个阶段的材料构建小RNA文库,进行了Solexa测序、miRNA鉴定、靶基因预测、qRT-PCR定量分析等研究。结果表明:发现的87个miRNAs中,29个为针叶树特异的,来自12个家族,分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、miR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704,其中25个长度为22nt,且在小RNA文库中的最低拷贝数为18(miR1311),最高拷贝数为33 009(miR950)。发现12个miRNA家族的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控;qRT-PCR分析表明:72%miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚,在中期子叶胚最低,最高峰在后期子叶胚,分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合,而miRNA前体的表达模式不同于miRNA,前体变化幅度小于成熟体。     

日本落叶松种子萌发过程中18个miRNAs的表达变化

运用qRT-PCR技术,检测日本落叶松种子萌发过程中的5个阶段——干种子 (萌发培养0 d)、吸胀(1 d)、萌动(5 d)、胚根外露(9 d)和子叶展开(28 d),miR156、miR159和miR160等18个miRNAs在其种胚内的表达模式,并对其目标基因进行生物信息学分析,探讨miRNA在针叶林木种子萌发过程中的基因表达模式。结果表明:(1)从整个萌发过程分析,18个miRNAs的表达水平皆以干种子阶段最高,吸胀和萌动阶段迅速下降;干种子阶段的表达水平分别是吸胀、萌动、胚根外露和子叶展开阶段的4.8 43.5、17.2 1 000.0、45.5 1 000.0、62.5 1 862.2倍。(2)从各个阶段分析,miR894的表达水平在5个阶段均最高,miR408均最低;其余16个miRNAs在5个阶段内的表达水平各有变化,综合排序结果从高到低依次为:miR951、miR950、miR156、miR159、miR396、miR398、miR390、miR160、miR947、miR165、miR319、miR162、miR171、miR397、miR395和miR172。(3)miRNA目标基因预测结果显示:目标基因主要是ATP/DNA结合蛋白、ARF等转录因子、质膜和核糖体等细胞组分及MAP等激酶活性蛋白等蛋白编码基因。(4)miR160对其目标基因JR160237 具有切割作用,切割位点发生在miR160与目标基因互补结合位点第10与11位碱基之间。JR160237在种子吸胀阶段表达水平迅速升高,在萌动、胚根外露和成苗阶段有所回落。