钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察,筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度,作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明:钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度-时间阈值,其最佳浓度和时间组合是0.1μM处理2min或者0.15μM处理0.5min,此时的囊胚率最高;钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生。     

葡萄糖在牛体外受精及胚胎发育中的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的葡萄糖,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育进行研究,通过观察顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率,筛选出获能液中最适葡萄糖浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度.结果表明:葡萄糖是精子获能和维持超激活运动的主要能源物质,其代谢过程中产生的活性氧在牛精子体外获能、受精过程中起重要作用,高浓度(超过9.15 mM)葡萄糖有利于获能的完成;但是对早期胚胎发育不利,对早期胚胎发育来说其最适添加量为6.10 mM,此时的囊胚率最高.     

不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能效果的影响

为了探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能的影响,试验随机取塔里木马鹿冻融精子,添加到SP-TALIP获能液中并添加不同浓度(0,10,20,50,100μg/m L)的肝素,在显微镜下检测0,2,4,6,8小时时的精子活力,试验采用金霉素(CTC)染色法检测精子获能率及顶体反应率等指标,探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子活力、存活时间、获能率、顶体反应率的影响。结果表明:精子活力随肝素浓度升高而呈下降趋势,4 h后10μg/m L和20μg/m L肝素组精子活力显著高于其他组(P0.05),其中20μg/m L肝素组精子存活时间最长,显著高于其他组(P0.05)。随着培养时间的延长,各试验组精子获能率与对照组相比明显提高,2小时、4小时时20μg/m L肝素组精子获能率显著高于其他组(P0.05);各试验组精子顶体反应率与对照组相比有升高趋势。说明获能液中添加20μg/m L肝素可有效诱导塔里木马鹿精子体外获能。     

波尔山羊精子体外获能及穿卵效果的研究

通过不同培养液对精子获能效果、获能后穿卵效果的比较,确定培养液的适宜配方及获能液中肝素的适宜添加浓度。精子用含有肝素的3种培养液进行获能处理,每个处理4个重复。试验设计了5个不同的肝素水平,即0、5、10、15、20μg/mL。于获能处理后4 h检查精子的顶体反应率、活力和活精子率。结果表明,添加15μg/mL和20μg/mL肝素能促进精子的获能效果和获能精子的穿卵效果。     

孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能的影响

试验探讨孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能和顶体反应的影响。将绵羊精子分别加到含不同浓度孕酮(1、10和100μmol/L)和雌二醇(1、10、和100μmol/L)的输卵管合成液(SOF)中,作用不同时间后分别取出部分精子样本进行金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC),通过精子与CTC结合染色的不同类型来评定孕酮和雌二醇对绵羊精子的作用。结果表明:雌二醇对绵羊精子体外获能和顶体反应都没有显著的促进作用(P>0.05);一定浓度的孕酮和雌激素组合抑制绵羊精子体外获能和顶体反应的发生(P<0.05)。     

钙离子载体及咖啡因对绵羊精子获能的影响

通过添加不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10μmol/L)的钙离子载体(A23187,IA)及2 mmol/L咖啡因,探讨不同作用时间其对绵羊精子体外获能的影响。结果发现,IA浓度越高,精子的体外获能率越高,顶体反应率越低,活力越低,死精子就越多;而延长作用时间对获能、顶体反应的影响不明显。IA和咖啡因共同作用后,咖啡因能够促进IA诱导顶体反应的发生。建议用IA诱导绵羊精子获能时,其浓度以0.05~0.2μmol/L为宜,作用时间1 min。     

培养液中不同浓度肝素对蓝狐精子体外获能的影响

采用上游法分离优化精子,以mTyrod's液作为基础培养液检测培养液中不同质量浓度肝素对蓝狐精子体外获能的影响,试验设4个肝素质量浓度:0,10,20,50 μg/mL,38.5℃、5%C02培养箱进行孵育,获能培养时间为6h.利用考马斯亮蓝染色法检测精子顶体反应率,伊红-苯胺黑染色法检测活精子比率,观测法检测精子活力...     

肝素、咖啡因、丙酮酸钠、BSA对延边黄牛卵母细胞体外受精效果的影响

试验为延边黄牛体外胚胎产业化生产奠定基础,进行了肝素、咖啡因、丙酮酸钠、BSA对延边黄牛体外受精效果的影响研究。结果表明,以改良BO液为基础液,添加20 μg/mL肝素时,精子顶体反应率和受精率分别为82.52%和75.34%,高于添加20 μg/mL咖啡因组(P<0.05)和添加10 μg /mL肝素与10 μg/mL咖啡因协同作用组(P>0.05);结合使用肝素(20 μg/mL),添加0.0020 g/mL丙酮酸钠时,精子顶体反应率和受精率分别为78.13%和71.57%, 高于添加0.0015 g/mL和0.0025 g/mL丙酮酸钠组(P<0.05);结合使用肝素(20 μg/mL),添加0.006 g/mL BSA时,精子顶体反应率和受精率分别为80.78%和71.44%,高于添加0.001 g/mL和0.003 g/mL BSA组(P<0.05)。因此,添加适当浓度的肝素、丙酮酸钠和BSA可显著提高延边黄牛精子体外获能效果及体外受精率。     

肝素浓度对辽宁绒山羊精子体外获能的影响

在TALP液中添加不同浓度(25、50、100μg/mL)的肝素对辽宁绒山羊精子进行获能处理,在显微镜下检测处理1、2、3、4、5h后的精子活力,用考马斯亮蓝染色法检测获能处理0.5、1、2、4h后的精子获能状况,探讨肝素浓度对绒山羊精子活力、存活时间、获能率的影响。结果发现,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下,精子活力随肝素浓度升高而下降,3 h以后25μg/mL肝素组精子活力显著高于其它肝素组(P<0.05)。添加肝素组获能率显著高于对照组(P<0.05),各肝素组精子获能率差异不显著(P>0.05)。对照组精子存活时间最长,25μg/mL肝素组精子存活时间为10.12 h,显著高于其它两组(P<0.05)。表明25μg/mL肝素处理辽宁绒山羊精子体外获能较为适宜。     

肝素或钙离子载体诱导牛、羊冻精体外获能的研究

本文采用肝素或钙离子载体(I-A)诱导牛、羊冻精体外获能,根据对去透明带仓鼠卵的穿透情况评定获能效果,并用台盼蓝·姬姆萨(TG)染色观察了精子的死活及顶体状态.结果发现,牛、羊冻精经肝素或I-A处理后与卵子一起培养,2 h穿透仓鼠卵,4 h开始形成雄原核,6 h形成发育良好的雄原核.牛冻精用50μg/mL肝素及0.1μmol/L I-A处理效果最好,穿透率分别为72.8％和92.3％;羊则以20μg/mL肝素及0.3μmol/L I-A为宜,穿透率分别为73.1％和68.O％.咖啡因与I-A或肝素并用均有协同作用,能提高精子的穿透能力,并能促进卵内原核的发育.肝素和I-A均能在体外诱导牛、羊冻精的顶体反应,有顶体反应活精子百分率与穿透率呈强正相关,羊冻精比较脆弱,获能处理后活力较低.     

米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响

本研究旨在探讨米非司酮（mifepristone,RU486）对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响。分别添加20 μg/mL RU486到精子获能液或穿卵培养液,检测小鼠精子顶体反应发生比率和穿透卵丘细胞层能力。结果显示,添加RU486能够极显著抑制孕酮（P₄,5 μg/mL）诱导的精子顶体反应（P ＜0.01）;并极显著减少穿透卵丘细胞层到达卵子透明带的精子数量及在卵子-卵丘细胞复合体（OCC）中精子发生顶体反应的比率（P＜0.01）;同时添加P₄和RU486情况下,相比单独添加RU486,虽然P₄能够极显著地促进精子穿透卵丘细胞层到达透明带,但对OCC中的精子顶体反应没有明显作用。综上表明,RU486能够抑制P₄诱导的顶体反应并影响小鼠精子穿透卵丘细胞层过程,揭示P₄/孕酮受体（PGR）通路在小鼠精子穿卵过程中具有重要作用。     

获能液及精子密度对牛性控精子体外受精成功率的影响

本实验探讨了不同的精子获能添加物、精子密度、精子获能液对牛性别分离精子体外受精（IVF）的影响。结果表明：受精液中同时添加10μg/mL的肝素与5mmol／L的咖啡因,能促进牛性控精子体外获能与受精。精子密度在1．0×10^6个/mL时其囊胚发育率最高。用BO液和mTyrode’s液对牛性控精子进行获能和受精处理．其受精效果差异不显著（P〉0．05）,但BO液作用时间短对早期胚胎的发育影响较小,比较适合牛性控精子IVF。     

二甲基亚砜对蓝狐精子活率和体外获能的影响

DMSO是一种有机溶剂,影响精子体外获能的孕酮、肝素、钙离子载体多溶于此溶剂,因此确定蓝狐精子最适合的DMSO浓度及其作用时间是十分必要的.试验将分离、优化的蓝狐精子置于BO液中,在38.5 ℃、5%CO2培养箱中进行获能培养,然后分别在6个浓度(0%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%)的DMSO中和4个时间(15分钟、30分钟、60分钟、120分钟)进行考马斯亮蓝染色和伊红-苯胺黑染色,检测并统计精子顶体反应率、精子活率,利用SPSS11.0统计分析软件分析试验数据.试验结果显示:蓝狐精子在DMSO浓度为0.2%和120分钟时体外获能效果最好.     

诱导牛精子体外获能方法的研究

用去透明带的金黄地鼠卵异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏,经各种处理后的精子穿卵率,结果表明,B0培养基,经咖啡因2mmol/L,肝素50μg/ml处理,并添加亚牛磺酸70μmol/L和透明质酸酶1g/L,是诱导牛精子体外获能的有效方法。     

谷胱甘肽对兔精液获能作用及获能相关基因表达的影响

笔者通过试验研究不同浓度还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)对精子获能的影响,以及与获能有关的关键基因在获能后相对表达量的差异。笔者在获能液中加入不同浓度GSH(0 mg/m L、5 mg/m L、10 mg/m L、15 mg/m L、20 mg/m L),并将其分别与精子悬液一同培养,以孕酮诱导顶体反应,通过涂片染色镜检得到顶体发生率;另外,试验中采用实时荧光定量PCR来得到获能相关基因蛋白激酶A催化亚单位β(PRKACB)和ACP6(acid phosphatase 6,lysophosphatidic)在获能后的表达。结果表明,获能液中添加GSH对兔精子获能有一定的影响。     

甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因(0、2.5、5.0、7.5mmol/L)或亚牛磺酸(0、5、10、20、40μmol/L)的获能处理液中,且每个处理组加入约200μL的精液,在CO_2培养箱里经上游处理45min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组(P0.05),且2.5mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组(P0.05),且20μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5mmol/L咖啡因组和对照组(P0.05)。因此,20μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

β-谷甾醇、淫羊藿苷对猪精子体外获能效果的影响

探讨中药单体成分β-谷甾醇(β-sitosterol)、淫羊藿苷(Icariin,Ica)对猪精子体外获能的影响,以期提高体外受精效果.以mTBM+肝素获能液为对照组,分别添加β-谷甾醇、淫羊藿苷的低、中、高3个剂量为试验组,利用金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC)法结合体外受精检验体外获能效果.在mTBM+肝素中添加β-谷甾醇2(中剂量0.08 mg/L)、淫羊藿苷2(中剂量17 mg/L)的B型精子率(获能精子)显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.05),F型精子率(未获能精子)显著低于对照组和其他剂量组(P＜0.05),AR型精子率(发生顶体反应精子)与对照组和其他剂量组差异不显著(P0.05),卵裂率和囊胚率均极显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.01);表明中药单体成分β-谷甾醇、淫羊藿苷能够显著促进猪精子体外获能效果.     

不同抗氧化剂对牛精子体外获能效果的影响

为探讨褪黑素、亚牛磺酸、左旋肉毒碱三种抗氧化剂对牛精子体外获能效果的影响,将荷斯坦牛细管冻精解冻后,各取200μL精液分别添加在含10~(-4) M褪黑素(MLT)、20μM亚牛磺酸(HT)、10 mM左旋肉毒碱(LC)的获能液中,经上游处理45 min,采用目测法、金霉素(CTC)染色法评估三种抗氧化剂对牛精子活力、精子获能状态的影响。结果表明:添加10~(-4) M MLT、20μM HT、10 mM LC经上游法获能处理后的牛精子活力(83.67%、80.65%、75.00%vs 66.67%)均显著高于对照组(P0.05),而顶体反应率(9.87%、10.09%、14.30%vs 18.73%)均显著低于对照组(P0.05)。另外,添加10 mM LC、10~(-4) M MLT组获能处理后B型精子所占比率(37.26%、29.84%vs 16.26%)均显著高于对照组(P0.05),且10 mM LC组精子获能率最高;而20μM HT组与对照组无明显差异(22.80%vs 16.26%,P0.05)。因此,添加10 mM LC、10~(-4) M MLT可改善精子体外获能效果,有助于提高体外受精的受精率及早期胚胎的质量。     

诱导牛精子体外获能的培养基及方法

用去透明带金黄地鼠异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏经各种处理后的精子穿卵率。发现在４种基本培养基（ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ、ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ－１６４０）中不加亚牛磺酸时,牛精子不能耐受较高浓度（４μｍｏｌ／Ｌ）钙离子载体（ＩＡ）的刺激（以１０ｍｉｎ计）;而低浓度ＩＡ（低于４μｍｏｌ／Ｌ）处理精子不能诱导获能。生物活性物质,如肝素、咖啡因、亚牛磺酸、肾上腺素单独或联合低浓度ＩＡ处理精子,短期（６ｈ）内也不能诱导获能。当基本培养基中含有亚牛磺酸时,牛精子能耐受高浓度ＩＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）的刺激,并使牛精子获能;亚牛磺酸与肾上腺素、咖啡因联合使用,并在获能液中添加透明质酸酶时,穿卵率进一步提高,获能效果显著改善。以ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ１６４０为主的混合培养基,在牛精子的存活时间、穿卵率等方面优于ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ培养基。结果表明,用Ｆ１０和１６４０的混合培养基,添加亚牛磺酸、肾上腺素、咖啡因、透明质酸酶,经１０μｍｏｌ／ＬＩＡ处理牛精子１０～１５ｍｉｎ,是快速诱导牛精子体外获能的有效方法