杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

栓皮栎AFLP反应体系的建立

以栓皮栎叶片为材料,研究了AFLP反应体系中酶切-连接反应的方法与时间、预扩增反应和选择性扩增反应等几个关键因素。建立一套适于栓皮栎基因组的AFLP反应体系:基因组DNA的提取宜采用改良的CTAB法;酶切-连接反应体系采用一步法,其中DNA模板用量为200ng,酶切-连接反应4h;酶切-连接产物用于预扩增反应的最佳稀释倍数为20倍;预扩增产物不需要进行稀释直接用作选择性扩增反应。对各环节的效果检测与引物筛选验证表明该体系适合栓皮栎的AFLP分析。     

马铃薯EcoRⅠ/MseⅠ内切酶组合AFLP反应体系的优化与引物筛选

以2个马铃薯品种为材料,对AFLP反应过程中的关键因素(DNA浓度、酶切体系、扩增体系等)进行了优化,旨在建立适合马铃薯的EcoRⅠ/MseⅠ内切酶组合的AFLP反应体系和筛选扩增条带丰富的引物。结果发现,优化的马铃薯AFLP反应体系为37℃酶切4 h,37℃连接4 h,连接产物稀释10倍用于预扩增,预扩增产物稀释30倍用于选择性扩增。利用建立的优化反应体系,以10个甘肃省主栽马铃薯品种为材料,从256对引物组合中筛选出24对扩增条带多、条带清晰、多态性好的引物组合。     

黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究

［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。     

砀山酥梨AFLP技术体系建立及变异检测

通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于砀山酥梨AFLP分析的技术体系:酶切体系25 μL,总体积中含纯化后的DNA 500 ng;EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各5 U,分步进行酶切;酶切完成后加入连接液,16℃连接过夜(8～12 h);连接产物稀释10倍用于预扩增;预扩增产物稀释15倍用于选择性扩增.应用确立的AFLP技术体系,对砀山酥梨的营养系变异类型进行了检测.结果表明,与砀山酥梨相比,8个营养系变异类型均出现了特异带,说明这些变异类型在遗传物质上发生了改变,属于芽变而不是彷徨变异.     

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）AFLP体系建立的研究

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）是一种优良的冷水性养殖鱼类,为了进行山女鳟养殖群体的遗传管理,本研究构建了山女鳟的AFLP分析体系,试验采用两组酶切组合酶切山女鳟基因组DNA,并对酶量及酶切时间、预扩增模板用量、预扩产物稀释倍数进行了优化。结果表明,100ng DNA用3U的EcoRI在37℃酶切3h后,再分别用3U的TaqI和Tru9I在65℃酶切4h连接效果最佳,取3μL连接产物进行预扩增,将预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,可以得到清晰的扩增图谱;对两组酶切组合进行对比发现,EcoRI-Tru9I组合扩增的条带数多于EcoRI-TaqI组合,但后者的多态性位点比例高于前者。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

华北落叶松AFLP反应体系的建立和优化

[目的]建立和优化华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtii Mayr.）的AFLP反应体系。[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素（酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数）进行了研究。[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0μl的前提下,酶切时间为7 h（37℃3.5 h;65℃3.5 h）,EcoRⅠ和MseⅠ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0μl（50 ng/μl）,连接产物稀释10倍取5.0μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0μl用于选择性扩增。[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究。     

基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究

为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。      

蒙古黄芪AFLP分子标记反应体系的建立与优化

以内蒙古特色药用植物黄芪为试验材料,建立并优化1套适用于黄芪的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。对AFLP反应体系的影响因素基因组DNA的提取、内切酶的确定及酶切时间、预扩增、选择性扩增反应等关键因素进行优化,并对AFLP适宜引物进行筛选。结果表明,黄芪基因组DNA的模板以50 ng/μL为宜,采用EcoRⅠ/MseⅠ进行双酶切,酶切连接采用一步法完成;最佳酶连时间为16 h;预扩增反应产物稀释20倍作为选扩模板,筛选出适用于黄芪AFLP分析的引物组合5对:E-AG/M-CGT、E-AT/MCTG、E-GA/M-CAA、E-TC/M-CAA、E-GT/M-CTG,为黄芪的分子标记辅助育种、遗传图谱构建、种质资源研究奠定了基础。     

披碱草属物种AFLP体系优化

试验对内切酶EcoRⅠ和MseⅠ的用量和酶切时间、预扩和选扩过程中模板稀释倍数以及扩增引物浓度分别进行了优化,并采用了Bassam法和Sanguinetti银染法进行了比较分析。结果表明:采用3UEcoRⅠ和MseⅠ这两种酶在37℃下酶切3 h,预扩模板稀释10倍和1.5 ng/μL引物进行预扩,选扩模板稀释20倍和2 ng/μL引物进行选扩,采用Bassam法进行银染,能够得到较好的试验结果,为AFLP进一步在披碱草属中的应用提供了参考。     

沙棘木蠹蛾AFLP引物筛选及反应体系的建立

该文以沙棘木蠹蛾幼虫为材料,用改进的SDS-蛋白酶K法获得了高质量的符合AFLP分析要求的基因组DNA。通过对AFLP试验过程中的酶切 连接、预扩增、选择性扩增等各关键因素的比较研究,建立了一套优化的沙棘木蠹蛾AFLP分子标记体系,获得了清晰的指纹图谱。研究结果表明:利用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切系统以酶切 连接2～4 h, 预扩增产物稀释20倍、Mg 2+浓度为1.5 mol/mL的选择性扩增效果最好。进一步利用该反应体系从80对E+3 /M+3选择性引物中筛选出10对多态性丰富、分辨率高、谱带清晰的引物组合。该研究结果为利用AFLP标记技术开展沙棘木蠹蛾的种群遗传结构、遗传分化等方面的研究奠定了基础。      

苹果基因组AFLP分析的DNA模板的制备及技术体系的建立

AFLP对模板的质量要求较高。在苹果上用常规的SDS法提取基因组DNA，若加以适当纯化，也可达到AFLP分析的要求，另外，在AFLP分析体系中，应注意选择性扩增模板的浓度，以及选用适当的引物组合，同时也应掌握好变性的条件。     

小麦条锈菌AFLP体系的优化

[目的]优化小麦条锈菌AFLP体系。[方法]以小麦条锈菌大田混合菌系为材料,采用改良CTAB法提取DNA,探索酶切、PCR过程,优化小麦条锈菌AFLP体系,并从64对引物中筛选出稳定、高效的引物组合。[结果]改良CTAB法有较好的破壁效果,所提DNA纯度高,条带清楚,无污染,适合AFLP操作。酶切3.0、3.5 h的效果相同,扩出的片断在100~2 000 bp,可进行预扩。TaqDNA聚合酶为0.5 U时,电泳图中出现了较亮的条带,片断大小在100~2 000 bp。16对引物组合可以扩增出较稳定的条带。[结论]优化的小麦条锈菌AFLP体系为:25.0μl酶切体系,37℃酶切3.0 h,10.0μl连接体系在22℃条件下连接过夜,连接产物、预扩产物分别按1∶10、1∶30的比例用ddH2O稀释后用于预扩和选择性扩增。     

菠菜AFLP反应体系研究(英文)

[目的]该研究旨在初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系。[方法]运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系中酶切连接、预扩、选扩等实验条件进行了优化分析。[结果]研究结果如下:(1)在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感。(2)菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl,Taq-polymerase(5U/μl)0.2μl最佳。[结论]该研究建立的AFLP反应体系对与菠菜基因组分析时稳定有效的,该技术体系为菠菜品种亲缘关系的AFLP分子标记分析和遗传育种等提供一定的理论基础。     

大竹蛏AFLP分子标记反应体系的建立与优化

[目的]建立一套适合大竹蛏的AFLP分子标记反应体系,为大竹蛏的遗传多样性研究提供技术支持。[方法]采用比较实验法,以大竹蛏基因组DNA为模板,对其AFLP体系中的酶切时间、预扩产物稀释倍数及选扩引物E＋3/M＋3的配比等进行优化。[结果]优化的AFLP体系为：酶切时的DNA模板浓度为100 ng/μl,双酶切2 h;预扩模板最佳用量1.0μl;预扩产物的最适稀释倍数为40倍;选扩引物浓度配比为1∶4。同时,筛选出12对引物组合,可用于大竹蛏的AFLP分析。[结论]采用优化的AFLP反应体系及筛选后的引物,对大竹蛏群体进行了初步扩增,得到了清晰的电泳图谱。     

泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物.     

我国紫薇属植物AFLP分子标记体系的优化

以采自广西、云南和河南等地的紫薇属Lagerstroemia植物紫薇L.indica,南紫薇L.subcostata,福建紫薇L.limii和桂林紫薇L.guilinensis叶片为材料,利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组DNA,获得了高质量的紫薇叶片DNA,并以其基因组DNA为模板进行了酶切连接,利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增的模板,最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增,进行紫薇和南紫薇的AFLP（扩增片段长度多态性）银染反应体系的优化。AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系,采用了160对引物作为初选引物,筛选出了10对适合紫薇基因组扩增的引物。结果表明,适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切、预扩增和选择性扩增体系为：酶切连接体系1;预扩体系3;选扩体系3,反应体系中Mg2＋质量浓度为1.2×10-6kg.L-1时扩增效果较好。     

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

【目的】建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持。【方法】以广西割手密GXS87—16、GXS85．30、GXS79—9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR I和Mse I酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如Mg^2＋、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化。【结果】样品DNA用限制性内切酶＆0RI和MseI各3u于PCR仪过夜可完全酶切。经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0．4μL dNTPs（20mmol／mL）,1．6μLMg^2＋（25mmol／mL）,2．0μL EcoRI—P（5pmol／mL）,2．0IxLMseI-P（5pmol／mL）,1UTaq酶（1U／μL）,DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0．4μL dNTPS（20mmol／mL）,0．8μLMg^2＋（25mmol／mL）,1．0μL EcoR I—AAG（6pmol／mL）,1．0μL Mse I-CAG（6pmol／mL）,3U Taq酶（1U／μL）,DNA模板稀释20倍。以对优化反应体系扩增获得的PcR产物用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱。【结论】建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持。