Cryopreservation ofTheileria-infected lymphoblastoid cells with functional assessment of viability

Summary Bovine lymphoblastoid cell cultures infected withTheileria annulata were frozen to −60°C in a programmable cooling apparatus using continuous cooling rates of 1°C/min, 10°C/min and 120°C/min and a two-step cooling rate with an equilibration period of 20 min at −30°C. The cryopreservative was DMSO at concentrations of 5, 10 and 15%. Aliquots of cryopreserved material were stored in the vapour phase of a liquid nitrogen refrigerator and resuscitated by rapid thawing in a 40°C water bath. The efficiency of the freezing methods was compared by assessing the viability and plating efficiency of cells after resuscitation, dilution and equilibration in cell culture medium. A significant correlation was recorded between the results obtained by these two methods which showed that the two-step method yielded cells with viability of 95 to 97% and a plating efficiency equal to that of unfrozen cells. It was concluded that such a freezing method would be ideal for the cryopreservation and storage of banks ofTheileria annulata-infected cells for vaccine purposes.

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Resumen Se congelaron a −60°C cultivos de células linfoblast bovinas infectadas conTheileria annulata. El proceso se llevó a cabo en un aparato enfriador programable, usando tasas de enfriamiento continuo de 1°C/min, 10°C/min y 120°C/min, y una tasa de enfriamiento de dos etapas, con un período de equilibración de 20 minutos a −30°C. El criopreservativo fue DMSO a concentraciones de 5, 10 y 15%. Se guardaron aliquotas del material criopreservado, et la fase vaporosa de un refrigerador de nitrógeno líquido, siendo resucitadas mediante el descongelamiento rápido en ba?o de maría a 40°C. La eficiencia de los métodos de congelamineto, se comparó evaluando la viabilidad y eficiencia de crecimiento en cultivos despues del descongelamiento, la equilibración y dilución en medios para el cultivo celular. Se obtuvo asi, una correlación significativa, entre los resultados provenientes de estos dos métodos, los cuales mostraron que el de dos etapas produjo células con una viabilidad de 95–98% y una eficiencia de crecimiento en cultivos, igual a las de las células sin congelar. Se concluyé, que este método de congelación sería ideal para la criopreservación y almacenamiento en bancos, de células linfoblastoides infectádas conTheileria annulata, para la producción de vacuua.

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Résumé Des cultures de cellules lymphoblasto?des bovines infectées parTheileria annulata ont été congelées à −60°C dans un appareil de congélation programmable, à des vitesses de 1°C/min, 10°C/min et 120°C/min et un rythme en deux temps avec une période d’équilibrage de 20 min à −30°C. Le cryopréservative était DMSO en concentrations de 5, 10 et 15%. Des échantillons aliquotes du matériel cryopréservé ont été conservés dans la phase gazeuse d’un congélateur à azote liquide et réanimés par décongélation rapide dans un bain-marié à 40°C. L’efficacité des méthodes de congélation a été jugée par l’estimation de la viabilité et de l’aptitude à coloniser des cellules après réanimation, dilution et équilibrage dans le milieu de culture cellulaire. On a obtenu une corrélation significative entre les résultats obtenus par les deux méthodes, le rythme en deux temps donnant des cellules dont la viabilité était de 95–97% et l’aptitude à coloniser égale à celle des cellules non congelées. Il a été conclu que cette méthode de congélation était idéale pour la cryopréservation et la conservation des banques de cellules infectées parT. annulata en vue de la préparation de vaccins.