β-琼脂糖酶ⅠDagA的原核表达和活性鉴定

采用PCR技术从假别单胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）19262基因组DNA中获得β-琼脂糖酶Ⅰ基因（dagA）及去除信号肽的编码序列dagA(▽)，分别与载体pET21a连接后转入大肠杆菌（Escherichia coli）ER2566中，共表达分子伴侣DsbC及FkpA，筛选出以包涵体为主要表达形式的高效表达体系：ER2566-pET21a-dagA(▽)-DsbC菌株。包涵体蛋白达到菌体总蛋白的60%左右。包涵体用8 mol/L尿素溶解、镍离子亲和层析纯化和梯度稀释复性。SDS-PAGE检测表明，复性后的DagA蛋白相对分子质量约为30.8 kD，且具有水解琼脂糖的生物活性。酶学特性分析表明，在pH 4.8~6.8范围内，DagA蛋白活性保持60%以上，最适pH 5.8；在温度37~60 ℃均有活性，最适温度为55 ℃。