| 摘 要： | 干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)-STING中重要的衔接蛋白,它能够识别细胞内第二信使环磷酸鸟苷-腺苷(c GAMP),激活I型干扰素(IFN-I)的表达。为了制备猪STING(pSTING)多克隆抗体(ppSTING)并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增pSTING基因构建重组表达质粒pGEX-6p1-pSTING,转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导后经SDS-PAGE和western blot方法鉴定GSTpSTING蛋白(rpSTING)的表达;利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法纯化rpSTING并免疫新西兰大白兔制备ppSTING,经Protein G亲和层析介质纯化后分别采用SDS-PAGE鉴定纯化的ppSTING。结果显示rpSTING以可溶形式表达,分子质量约为52.5 ku。SDS-PAGE结果显示,制备的ppSTING包含重、轻链且纯度较好。将ppSTING分别应用于western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测外源表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING;将其应用于Co-IP试验检测ppSTING与外源表达pSTING的相互作用;将其应用于激光共聚焦试验检测cGAMP刺激后的PK-15细胞中内源表达的pSTING与AP-1在该细胞中的共定位;将其应用于western blot检测ASFV感染后PAMs中的pSTING蛋白。Western blot和IFA结果显示,制备的ppSTING能特异性地识别HEK293T细胞中过表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING蛋白;Co-IP结果显示,ppSTING与pSTING蛋白存在相互作用;激光共聚焦试验结果显示,ppSTING可用于检测PK-15中内源表达的pSTING蛋白且在cGAMP刺激后的PK-15细胞中的pSTING能够与AP-1定位于高尔基体。Western blot结果显示,ppSTING能够与未感染ASFV的PAMs中内源表达的pSTING蛋白反应,且在ASFV感染PAMs 24 h后pSTING蛋白的表达量增加。上述结果表明,本研究制备了ppSTING并且证实其可以用于宿主天然免疫方面的应用研究。本研究为探究pSTING蛋白的生物学功能以及cGAS-STING信号通路奠定了基础。
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