新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7，KAP7）基因多克隆抗体，为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料，提取总RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因，构建pMD19-T-KAP7克隆质粒，对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析，再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达，SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白，经提取、纯化、回收得到目的蛋白，用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清，并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明，与美利奴羊比对，平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%，但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C，造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg；山区型和田羊第70位碱基由A变为C，造成其24位氨基酸由Thr变为Ala；卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%，其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白，其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性，其抗体效价达到1：10 000。

Prokaryotic Expression and Preparation Polyclonal Antibody of Wool Follicle KAP7 Gene of Hetian Sheep and Karakul Sheep in Southern Xinjiang