蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域，设计特异性引物，优化反应条件及反应体系，进行特异性及灵敏度验证，建立BTV RT-LAMP检测方法；对46株中国分离的12种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24）代表毒株进行检测，进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测，验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明，本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃，扩增45 min；反应体系中外引物：内引物：环引物的最佳浓度及比例为0.2 μmol·L^-1：0.6 μmol·L^-1：0.4 μmol·L^-1。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸，与动物流行性出血病病毒（EHDV）、中山病毒（CHUV）、阿卡斑病毒（AKAV）、口蹄疫病毒（FMDV）及非洲马瘟病毒（AHSV）核酸均无交叉扩增现象；最低可检测4.5拷贝·μL^-1的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性；120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别（McNemar检验P>0.05），符合率为95.0%；60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致，以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠，对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点，为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持，具有较好的应用前景。