IHHNV PCR检测方法改进及广西流行株基因型分析

【目的】建立并优化传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测及其基因分型的套式PCR,并确定IHHNV在广西流行的基因型,为有效防控广西对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)提供参考依据。【方法】在以PCR检测IHHNV现有标准的基础上,于389F/R和309F/R两对引物扩增片段之外的绝对保守区域设计外引物IHHNVWF/WR,优化退火温度和引物浓度后建立IHHNV检测及基因分型的套式PCR,并通过与一步法PCR对比以验证其优越性;采用建立的套式PCR对546株2010—2018年收集的IHHNV广西流行株进行基因型分析,确定IHHNV在广西流行的基因型。【结果】优化后的第一轮PCR反应体系20.0μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各0.8μL,DNA模板2.0μL,无核菌酶灭菌水补足至20.0μL。扩增程序:94.0℃预变性3 min;94.0℃10 s,59.0℃15 s,72.0℃15 s,进行35个循环;72.0℃延伸5 min。套式PCR检测IHHNV的灵敏度较一步法PCR提高100倍;对100份IHHNV阳性临床样品的检测结果与一步法PCR的检测结果一致,符合率达100%。从546株IHHNV广西流行株中均能扩增获得309 bp的目的条带,全部为感染型(基因1型和基因2型)。【结论】在PCR检测IHHNV现有标准基础上建立的IHHNV检测及基因分型套式PCR,其灵敏度较一步法PCR提高100倍,尤其适用于检测IHHNV含量低的样品,可为疫病监测及进出口检疫提供更敏感的技术手段。当前广西流行的IHHNV均为感染型(基因1型和基因2型)。