紫薇叶片原生质体的分离及瞬时转化

【目的】研究紫薇叶片原生质体的分离方法，并对制备的原生质体进行瞬时转化，为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。【方法】以F₁株系S047（以屋久岛紫薇（L. fauriei）为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得）及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料，对其进行酶解，筛选最适紫薇品种，在此基础上，采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度（5，10，15，20，25，30 g/L）及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8 mol/L)，之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶（10,20,30 g/L）、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度，确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇（PEG）介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。【结果】分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系，其在酶解过程中无褐化现象，分离液呈明亮绿色，可得到完整的原生质体；其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示，最适的纤维素酶质量浓度为15~20 g/L，离析酶质量浓度为5~10 g/L，甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明，10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液，在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h，可成功分离出紫薇原生质体，其产量达28×10⁵ g^-1，破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号，表明基因转化成功。【结论】获得了紫薇叶片原生质体分离体系，并成功进行了基因瞬时转化。