pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体,制备转双基因(pGH+IGF-Ⅰ)猪,以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响,为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA,经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列,经酶切连接克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体上,构建pc DNA3.1(+)-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞,Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子,采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体,Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明,成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体,转染PK15细胞后,Q-PCR检测表明,pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪,经PCR及测序检测,其中4头仔猪为转双基因阳性,转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因,证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在,并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因,证明外源基因存在稳定传代的可能。