从蛋白质和转录水平鉴定类猪圆环病毒P1存在ORF2和ORF3

【目的】确定类猪圆环病毒P1 存在开放阅读框ORF2 和ORF3；【方法】采用Trizol 法，提取类猪圆环病毒 P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA，纯化之后，分别用P1 ORF2 和 ORF3 特异性引物进行RT-PCR，应用AxyPrepTM DNA 凝胶回收试剂盒回收PCR 产物，转化Trans5α 感受态细胞，挑取单菌落，经PCR检测为阳性后测序。同时，利用rapid-amplification of cDNA ends (RACE) 技术分别扩增P1 病毒 ORF2 和 ORF3 的5′-与3′-末端。另外，根据P1 ORF2 和ORF3 的序列预测其B细胞抗原表位，采用标准的逐步固相合成法合成表位肽，与载体蛋白KLH偶联后，免疫新西兰大白兔制备抗 P1 ORF2 和ORF3 的多克隆抗体。采用常规间接ELISA法检测分离血清效价，包被抗原用合成肽，450 nm 波长下测定，血清抗体效价为S/N ≥2.1的血清最高稀释度。 然后，用P1 双拷贝分子克隆转染PK-15细胞，通过免疫组化方法对该多抗与P1 的反应性进行检测，同时利用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中P1 的拷贝数。【结果】利用ORF2和ORF3特异性引物对P1 RNA 进行的RT-PCR，均能扩增出目的片段，回收测序大小分别为111 bp和128 bp，分别与P1 ORF2 和ORF3 进行同源性比较，序列同源性均为100%；RACE技术分析，得到P1 ORF2 的5′-和3′-RACE 末端分别为第11位（G) 和第168位（T)，P1 ORF3 的5′-和3′-RACE 末端分别为第285位（T) 和第 579位（A）。根据预测结果，合成肽的氨基酸序列分别为ORF2：CLSRLPQSERPPGRW和ORF3：CVYPKVRERRVLKMP；用ORF2 和ORF3 表位肽与载体蛋白KLH 的偶联物免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价均达到1﹕512 000以上，并且能够与P1 病毒发生特异性显色反应，应用蓝色DAB显色试剂盒染色结果为紫蓝色，多数在细胞浆，少数在细胞核，而对照组细胞无显色反应。定量PCR检测结果显示，P1可以在转染P1双拷贝分子克隆的PK-15细胞中复制，并且转染后104 h 增殖量达最大。【结论】通过转录分析和免疫组化试验分别从转录和蛋白质水平上证实了类猪圆环病毒P1 存在ORF2 和ORF3。