灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm），将其在原核细胞中进行表达，纯化Tm蛋白，免疫大白兔并制备其多克隆抗体，为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame，ORF）。提取灰飞虱总RNA，采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF，连接至pMD-18T载体后进行测序分析，利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液，进行超声波破碎处理，收集上清及沉淀，采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白，经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白，免疫大白兔，制备多克隆抗血清，并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后，用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测，分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示，灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析，结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp，编码283个氨基酸，理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析显示，融合蛋白大小约为55 kD，主要以可溶性蛋白形式表达，在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白，免疫大白兔，制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度，效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白，分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带，表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达，纯化获得了Tm融合蛋白，制备了高效价的Tm多克隆抗体。

Cloning,Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Tropomyosin Gene in Laodelphax striatellus Fallén