苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5，并进行表达分析及蛋白互作检测，为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析，筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对，根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5，同时对cDNA序列设计引物进行克隆；利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析，同时对蛋白进行保守结构域分析；取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析；通过对MdHY5启动子序列进行预测分析，并结合拟南芥同源基因芯片数据，进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上，利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测，并进行蛋白纯化；利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析，在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员，聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高，该基因位于苹果基因组12号染色体上，基因编号为MDP0000586302，与拟南芥AtHY5结构相似，MdHY5也含有4个外显子，3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp，其中5′非编码区长度为214 bp，3′非编码区长度为403 bp，开放阅读框长度为495 bp，编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示，MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain），其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达，其中叶片中表达水平最高，花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现，MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件，而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导，而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导，菌体经超声波破碎后显示，融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验，结果显示，MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子，是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因，与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构，在叶中表达量最高，同时对多种光质具有表达响应，能够与MdCOP1互作。