苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因，分别构建其超量表达载体，并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因，利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定，并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析；通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体，并在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介导下，通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中，通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株；利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平，并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因，命名为BnGS2-1和BnGS2-2，等位基因序列全长1 340 bp，含有一个1 293 bp的ORF区，编码430个氨基酸残基多肽；等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异，导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象（BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺，BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸）；NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系；构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体，并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株；与野生型烟草植株相比，超量表达BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量，株高和总氮含量也有增加，但没有达到显著性水平。另外，超量表达不同BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）的转基因烟草植株，在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因（BnGS2-1或BnGS2-2）均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率，并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。

Cloning of Glutamine Synthetase BnGS2 Allele Genes from Ramie (Boehmeria nivea L.) and Study on Gene-Transforming Tobacco