飞蝗LmGSTS2的酶学特性及其对马拉硫磷、 p,p’-DDT的代谢分析 |
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引用本文: | 马雯,刘娇,张学尧,申国华,秦雪梅,张建琴.飞蝗LmGSTS2的酶学特性及其对马拉硫磷、 p,p’-DDT的代谢分析[J].中国农业科学,2019,52(8):1389-1399. |
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作者姓名: | 马雯 刘娇 张学尧 申国华 秦雪梅 张建琴 |
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作者单位: | 1 山西大学中医药现代研究中心,太原 0300062 山西大学应用生物学研究所,太原 0300063 山西省食品药品检验所,太原 030001 |
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基金项目: | 国家自然科学基金国际合作项目(30810103907);山西省应用基础研究项目(201601D202058);2016省级配套国家科研项目(226546001);地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室(201605D111004) |
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摘 要: | 【目的】将飞蝗(Locusta migratoria)谷胱甘肽硫转移酶sigma2(glutathione-S-transferases sigma2,LmGSTS2)在大肠杆菌中原核表达后进行纯化,研究LmGSTS2的酶学特性,并分析其对马拉硫磷和p,p’-DDT的代谢作用。结合飞蝗体内LmGSTs2的RNA干扰及杀虫剂生物学测定,评估LmGSTS2对杀虫剂的代谢解毒能力,为飞蝗抗性治理及合理施药提供理论依据。【方法】将LmGSTS2在BL21(DE3)中表达,通过Ni-NTA亲和层析对LmGSTS2进行纯化,以CDNB为底物检测LmGSTS2在不同温度和pH条件下的酶活性变化。在最适条件下(pH=7,27℃),用纯化的LmGSTS2蛋白与马拉硫磷和p,p’-DDT进行孵育,通过超高效液相色谱(UPLC)评估LmGSTS2对马拉硫磷和p,p’-DDT的代谢解毒能力。进一步将3 μg dsLmGSTs2注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后检测目的基因LmGSTs2的沉默效率,并结合杀虫剂生测试验分析飞蝗对杀虫剂敏感度的变化。【结果】将LmGSTS2在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE检测后,发现与两个对照组pET28a/BL21(DE3)和未诱导的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2相比,诱导后的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2总蛋白在25 kD左右出现与目标蛋白大小相符的单一条带,表明LmGSTS2成功表达。对纯化后LmGSTS2蛋白的酶学特性研究结果表明,其最适反应pH范围为6—8,在pH=7时酶活性达到顶峰;最适反应温度范围为25—30℃,27℃时活性最高。在最适条件下,LmGSTS2分别与马拉硫磷和p,p’-DDT进行孵育。UPLC结果显示,与3个对照组相比(GSH+insecticide、active LmGSTS2+insecticide及inactive LmGSTS2+GSH+ insecticide),LmGSTS2组马拉硫磷色谱峰面积分别降低83.6%、84.0%和84.6%,差异显著(P<0.05),而p,p’-DDT色谱峰面积与对照组相比无显著变化(P>0.05),说明LmGSTS2可对马拉硫磷进行代谢,对p,p’-DDT无代谢作用。进一步通过RNA干扰结合杀虫剂生测在飞蝗体内检测LmGSTS2蛋白对马拉硫磷的代谢解毒作用。将靶标基因的双链RNA注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后可使飞蝗体内LmGSTs2表达量抑制96%。飞蝗对马拉硫磷的敏感度检测发现,与对照组相比,LmGSTs2基因沉默后飞蝗对马拉硫磷的敏感度增加,死亡率由29.9%上升至45.2%,表明LmGSTS2参与了马拉硫磷在体内的代谢解毒过程。【结论】将LmGSTS2在体外进行表达纯化,并以CDNB为底物检测到该酶最适反应条件为pH=7,27℃左右;对马拉硫磷的体内和体外检测结果显示,LmGSTS2参与马拉硫磷在飞蝗体内的代谢解毒过程;对p,p’-DDT的体外研究结果显示该酶不参与p,p’-DDT的代谢。
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关 键 词: | 飞蝗 杀虫剂 谷胱甘肽硫转移酶 超高效液相色谱 RNA干扰 |
收稿时间: | 2018-11-23 |
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