| 摘 要： | 【背景】地磁场(geomagnetic field,GMF)并不是稳定不变的,其随时间和空间时刻变化。目前,随着对动物磁生物学研究的日益深入,基于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术开展的磁响应基因转录表达谱研究有力促进了磁响应通路的鉴定和磁感受机制的揭示。【目的】筛选近零磁场(near-zero magnetic field,NZMF)下短翅型灰飞虱(Laodelphax striatellus)稳定表达的内参基因,使对目的基因的定量分析更加准确。【方法】迁飞性昆虫灰飞虱采自江苏省农业科学院试验田并在室内使用TN1三叶期稻苗进行扩繁(温度:(25.0±1.0)℃,相对湿度:70%—90%,光周期:14L﹕10D)。采用亥姆霍兹线圈室内模拟近零磁场(NZMF;500 nT)和地磁场(GMF;～50 000 nT),人工模拟磁场强度有效处理空间为直径30 cm的球形空间,试验过程中严格控制除磁场强度外的环境因子(温度:(25.0±1.0)℃,相对湿度:75%,光周期:14L﹕10D)并利用磁通门计每日对人工模拟磁场进行校准和监测,灰飞虱连同TN1三叶期稻苗均置于试管中进行暴露处理,每隔两日与对照磁场中稻苗对调以避免稻苗潜在磁响应对灰飞虱的影响。利用Trizol法分别提取初羽化灰飞虱雌、雄成虫总RNA,检测各生物学重复RNA质量并调至含量一致,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术并结合常用内参筛选分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder对在NZMF和GMF两种磁场强度下灰飞虱体内的内参基因稳定性进行评估筛选,其中,待评估的11个常用内参基因包括Actin1、Tubulin(α1TUB和α2TUB)、Elongation factor 1alpha(EF-1α)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Ubiquitin(UBI)、Ribosomal protein S11(RPS11)、Ribosomal protein S15e(RPS15)、Ribosomal protein L8(RPL8)、Ribosomal protein L9(RPL9)和ADP ribosylation factor2(ARF2)。【结果】不同磁场环境(NZMF vs. GMF)下,灰飞虱短翅雌成虫EF-1α和RPL9表达稳定性在geNorm和NormFinder两种评估方法中都居于前两位,与BestKeeper软件的结果略有差异,进而利用在线工具RefFinder对以上3种方法的评估结果进行稳定性综合排序,结果表明EF-1α稳定性最好,RPL9稳定性次之;灰飞虱短翅雄成虫中,基于geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种评估方法,α2TUB和RPL9表达稳定性中均居于前两位,而Actin1表达稳定性虽在NormFinder和BestKeeper中处于前两位,但其在geNorm中稳定性较低,最后,通过在线工具RefFinder综合分析表明,α2TUB稳定性最好,RPL9稳定性次之。【结论】明确了不同磁场强度(NZMF vs. GMF)下适用于灰飞虱短翅雌、雄成虫中稳定表达的内参基因,其中,若使用双内参系统,雌成虫中可使用EF-1α和RPL9搭配,雄成虫中可使用α2TUB和RPL9搭配,为稳定表达的内参基因系统。此外,RPL9在灰飞虱短翅型雌、雄成虫中均可作为稳定的单一内参基因使用。研究结果确保了对灰飞虱响应磁场强度变化研究中关键目的基因转录表达的准确定量,并为今后开展磁场强度变化下的转录表达谱分析提供了有力保障。
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