小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。