SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法，针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物，同时选择了1对内参基因B—actin引物，将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，梯度倍比稀释作为标准品，用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明，建立的标准曲线具有良好的线性关系，R^2均在0．99以上；最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品，且具有良好的重复性，能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见，SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求，具有快速、敏感性高、重复性好等特点。