| 摘 要： | 人补体调节蛋白(human complement regulatory protein,h CRP)基因,如人类簇分化抗原55(human cluster of differentiation 55,hCD55),在异种器官移植中尤为重要。本研究在α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪(Sus scrofa)耳成纤维细胞的基础上,利用CRISPR/Cas9技术在猪Rosa26(reverse orientation splice acceptorβ-geo26)基因座敲入hCD55基因,以制备hCD55基因高效表达的细胞系。分别构建靶向切割pRosa26位点intron 1(内含子1)的Cas9表达载体,及pRosa26位点同源重组hCD55的表达载体,后者包含异源Loxp位点间的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1α)启动子调控的hCD55基因、潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,HPH)、胸腺激酶基因(thymidine kinase,TK)为正负筛选基因。将Cas9-Rosa26表达载体和p EF1α-hCD55表达载体共电转染猪耳成纤维细胞系,培养液中加入丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(hygromycin,Hyg)进行筛选,培养至单细胞克隆。通过跨5'端和3'端同源臂的两对引物PCR检测目的基因整合情况,反转录(reverse transcription PCR,RT-PCR)和Western blot检测hCD55在细胞中的表达情况。药物筛选后得到94个克隆点,经PCR鉴定,定点整合hCD55的阳性克隆点2个,定点整合效率为2.1%。RT-PCR结果显示,阳性克隆点细胞表达hCD55基因,Western blot结果进一步证实hCD55在细胞有表达。本研究在GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞系基础上成功构建了表达目的基因hCD55的细胞系,为异种移植供体猪的制备提供了基础资料。
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