酵母双杂交筛选与呼肠孤病毒σ1、σ1S互作宿主蛋白

提取猪肠上皮细胞IPEC-1的总RNA,构建了IPEC-1的靶标cDNA文库。随机挑取文库克隆子进行PCR扩增,发现插入片段长度为200～1 500bp,文库的重组率为100%。以猪源呼肠孤病毒GD-1株S1基因节段为模板,通过PCR扩增,定向克隆构建诱饵载体pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s。通过菌落PCR和测序验证的质粒被转化至酵母菌株Y2H Gold,诱饵载体pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s均能在酵母细胞中正确表达出对应的σ1和σ1S蛋白,且无自激活活性,对酵母细胞无毒性,满足文库筛选实验的要求。将含有pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s的酵母菌株Y2H Gold分别与靶标cDNA文库菌株Y187进行杂交,筛选、验证、测序后得到13个与σ1、6个与σ1S相互作用的宿主蛋白,其中的1个蛋白与σ1、σ1S同时存在相互作用。本试验成功构建了适用于研究肠道细菌、病毒作用机制的猪肠上皮细胞IPEC-1cDNA文库,筛选出18个与猪呼肠孤病毒σ1或σ1S的互作蛋白,为研究呼肠孤病毒与宿主相互作用,以及鉴定疾病控制的新靶标提供了线索。