飞蝗3个细胞色素P450基因的分子特性及功能

【目的】研究飞蝗（Locusta migratoria）细胞色素P450（CYP450）第四家族（CYP4）中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料，依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物，利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列，命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1（GenBank登录号： KF857162、KF857163和KF857164）。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1，实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力，通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30，同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列，其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp，编码506个氨基酸；CYP4C73开放阅读框1 521 bp，编码 507个氨基酸；CYP4DH1开放阅读框1 512 bp，编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析，发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期，CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达，在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高；不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达，CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰，发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量，分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明，双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后，飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比，没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列，这些基因均可被双链RNA干扰而沉默，但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后，飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。

Molecular Characteristics and Functional Analysis of Three Cytochrome P450 genes in Locusta migratoria