应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因

【目的】葡萄新梢上的芽有冬芽和夏芽两种，根据这两种芽休眠特性的差异，筛选与芽生理休眠相关基因，进而从分子水平研究葡萄芽生理休眠的相关机制。【方法】以‘赤霞珠’葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料，夏芽作为驱动方（driver），冬芽作为实验方（tester），采用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）构建冬芽和夏芽的SSH-cDNA文库，筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段。通过NCBI同源比对，寻找与葡萄芽生理休眠相关的基因，并对差异表达基因进行功能注释和分类。最后，运用Real-time PCR技术对部分候选基因进行检测，以验证其与葡萄芽生理休眠的相关性。【结果】共获得359条有效、高质量的差异基因片段，经CAP3软件聚类拼接，得到106个unique EST。在GenBank中进行BLASTN同源比对，有98条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性，占全部EST的92.4%。进行BLASTX同源比对，有54条EST与功能已知蛋白或基因具有不同程度的同源性，占全部EST的51%。已知功能的EST涉及休眠、逆境胁迫、细胞代谢、胞内物质运输等方面，且绝大多数基因信息来源于葡萄、苜蓿、橄榄、油菜、高粱、棉花、大蒜、拟南芥等植物。对差异基因片段进一步的功能分析发现，调控开花的基因占生物学过程的20%；与环境胁迫相关的基因占生物学过程的6%；与细胞代谢相关的基因占生物学过程的20%；与胞内物质运输相关的基因占总生物学过程的6%；其他包括DNA转录、减数分裂、细胞死亡及细胞壁松弛作用等。这些基因的分子功能主要有半胱氨酸型肽链内切酶、甲基转移酶、蛋白激酶、催化活性、结构分子活性、蛋白结合功能、DNA结合功能、ATP结合功能、蛋白质二聚体催化活性及丙酮酸氨基转移酶活性等。经Real-time PCR检测得知，在夏芽萌发过程中，候选基因在冬芽和夏芽中表达量呈不规律变化，且同一基因在相同节位的冬芽和夏芽中表达量均有较大差异。【结论】发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因，如编码MADS FLC-like蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素P450、细胞壁关联蛋白等基因，认为线粒体蛋白基因、未知蛋白基因、开花相关基因、ATP合成酶β亚基基因、MADs FLC-like蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。

Screening and Identification of Differentially Expressed Endodormant Genes from Latent Buds and Prompt Buds by Suppression Subtractive Hybridization