黏质沙雷氏菌次生代谢物对TMV的抑制机理

【目的】分离、纯化和鉴定黏质沙雷氏菌2A2次生代谢物中具有抑制TMV侵染力的活性成分,明确其对TMV的抑制机理。【方法】通过病毒生物学测定,确定黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV的抑制效率。为明确黏质沙雷氏菌2A2发酵液次生代谢物中抑制TMV侵染力的活性成分,通过TLC和硅胶柱层析对其发酵液进行了分离纯化,获得主要的次生代谢物,通过局部枯斑法测定各代谢物的生物学活性,筛选可显著抑制TMV侵染活性的物质,经NMR分析,确定其成分结构,进而确定物质组分。为进一步揭示代谢物对TMV的抑制机理,利用透射电子显微镜探索代谢物对TMV粒体形态的影响,TMV粒体与代谢物甲醇溶液混合30 min后,于透射电子显微镜下观察TMV粒体形态。同时,用代谢物甲醇溶液喷施处理寄主下部3片叶,共设5个处理：处理Ⅰ,喷施代谢物24 h后,接种TMV;处理Ⅱ,代谢物与等体积TMV汁液混合30 min后,接种叶片;处理Ⅲ,先接种TMV,24 h后喷施代谢物;处理Ⅳ,宁南霉素（50 μL•mL-1）与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做阳性对照;处理Ⅴ,无菌水与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做空白对照。分别在次生代谢物诱导和TMV侵染后1、3、5、7、9 d,取未经任何处理的上部叶,TRIZOL法快速提取总RNA并反转录cDNA,利用real-time RT-PCR分析样品PR基因和TMV的RNA相对表达量,进而明确代谢物处理寄主对寄主PR基因表达的影响和对TMV在寄主体内复制增殖的抑制作用。【结果】黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV具有显著的抑制作用。对其发酵液进行分离纯化,获得3种主要代谢物,通过局部枯斑法测定,编号为BJH-2的代谢物可显著抑制TMV的侵染活性,经NMR分析,确定了该代谢物为灵菌红素（prodigiosin）。透射电子显微镜结果显示灵菌红素可显著破坏TMV粒体,使TMV典型的杆状病毒粒体降解断裂成排列紊乱的短杆状。real-time RT-PCR结果表明,灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ可诱导寄主体内PR基因表达随着时间逐渐上调,第7 天左右,三者处理的寄主体内PR1、PR2、PR4、PR5表达上调至高峰,显著高于空白对照,亦高于处理Ⅳ的阳性对照,从而提高系统抗性;灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ寄主体内TMV RNA的表达量随着时间上调减缓,在接种TMV后的第9天,三者处理的寄主体内的TMV RNA含量分别是空白对照的11.98%、5.23%、15.90%,显著低于空白对照,亦低于处理Ⅳ的阳性对照。【结论】灵菌红素既对TMV在寄主体内的复制增殖具有抑制作用,又可诱导寄主产生系统抗性,整体效果高于宁南霉素,可作为防治植物病毒新的生物制剂。