亚洲璃眼蜱不同发育阶段及其组织中microRNA-10表达分析

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-22个核苷酸（nt）且高度保守的非编码小RNA。迄今为止，在病毒、动物、植物中都有发现，如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制，在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能，试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列；分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平，及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义；为进一步研究miR-10与亚洲璃眼蜱生长发育间的关系奠定基础。【方法】用Trizol Reagent分别提取不同发育阶段及组织的总RNA,用SYBR ®Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit( TaKaRa Code: RR716) 制备cDNA。参考miRBase数据库中isc-miR-10（登录号：MI0012262）序列，设计特异性引物，通过PCR的方法从亚洲璃眼蜱中扩增获得miR-10前体序列，通过MEGA4软件将此前体序列与已知物种的miR-10前体序列进行比对分析；利用qPCR技术分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达情况；推测miR-10在亚洲璃眼蜱中的生物学功能。【结果】获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG，大小为73bp；亚洲璃眼蜱的miR-10前体序列与肩突硬蜱的相似性最高，是95.9%，且与其他节肢动物相似性在88.9%-91.7%之间；miR-10在不同物种间高度保守。miR-10的成熟体序列为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU，种子序列为ACCCUGU。在亚洲璃眼蜱的不同发育阶段中，饥饿若蜱的miR-10的表达水平最高，是卵的48.3倍；饥饿成蜱是卵的7.78倍；饥饿幼蜱是卵的2.78倍。在饥饿雌性成蜱吸血过程中，吸血3d的成蜱是饥饿成蜱的约4.28倍，吸血5d的成蜱是饥饿成蜱的约0.31倍，饱血自然脱落的成蜱是饥饿成蜱的约0.087倍。吸血初期miR-10的表达量上调，随着吸血时间的延长其表达量逐渐下调；在唾液腺、气管、卵巢、表皮、中肠中miR-10的表达情况有明显不同，其中唾液腺的表达量最高，是表皮的13.2倍；卵巢的表达量是表皮的2.98倍，气管的表达量是表皮的6.46倍。【结论】从亚洲璃眼蜱中克隆miR-10序列，序列分析显示此序列在节肢动物中相对保守。miR-10在亚洲璃眼蜱不同发育阶段及不同组织的表达明显不同，表明其表达具有选择性；依据miR-10表达的差异性及已报道miR涉及的生物学功能，推测miR-10在亚洲璃眼蜱的细胞增殖、发育及吸血方面有潜在的重要作用。本研究为寄生虫miRNAs功能的研究提供一定的依据，并有可能为防控寄生虫疾病开辟新的途径。

Analysis of the Relative Expression of microRNA-10 in Different Developmental Stages and Various Tissues of Hyalomma asiaticum