杜梨PbGID1家族基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及遗传转化

为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能，以杜梨为试材，通过同源克隆方法得到PbGID1s基因，利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点；利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上；通过农杆菌介导方法，将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明，在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成；氨基酸序列比对发现，PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域；将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_35S-N植物表达载体上，可同时对该家族4个基因进行编辑；杜梨遗传转化试验结果表明，共计浸染595粒杜梨子叶，获得抗性芽176个，阳性植株33株，转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体，通过农杆菌介导，成功将该载体转化至杜梨子叶，并获得阳性植株。