溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用，本研究采用Overlap PCR和同源重组技术，构建了kdpD/kdpE（kdpDE）基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究，发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显，但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示，突变株毒力下降78.5倍，表明减毒株构建成功，可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示，注射免疫7 d后，鱼体内不能检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原，分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼，免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒，评估该减毒活疫苗及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明，免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染，其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%，浸泡免疫组次之（66.7%）；同时，该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应，其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%，浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明，kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的候选减毒活疫苗。

Construction of an attenuated two-component regulatory system KdpDE strain of Vibrio alginolyticus and evaluation of its immunogenic and protective effects as a vaccine