仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立

为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征，促进仿刺参养殖业的健康可持续发展，利用LwCas13a中特异性CRISPR RNA(crRNA)与靶RNA结合后可激活Cas13a蛋白对外源RNA分子附属切割活性的特征，结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(RPA),建立1种针对灿烂弧菌gyrB基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法——RPA-Cas13a。RPA-Cas13a可实现在37℃恒温下、60 min内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示，RPA-Cas13a检测限为550拷贝/μL(gyrB),与荧光定量PCR的检测灵敏度水平一致；特异性测试结果表明，RPA-Cas13a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应，特异性较强。RPA-Cas13a方法对仿刺参体表黏液(32份)、养殖池塘水体(15份)和表层沉积物(10份)等57份环境样本的阳性检出率为8.77%,与传统荧光定量PCR方法的检出一致性高(Kappa=1.00),无统计学差异(P>0.05)。试验结果表明，灿烂弧菌的RPA-Cas13a...