牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子，探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织，提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列，EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征；构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体，双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区；应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子；构建转录因子过表达载体，转染至293T细胞，分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明，牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件；构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性，-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强，为牛CART基因核心启动子区；转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合；进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...