甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因（SoNADP-IDH）的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C₄作物，是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因，为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点，用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定，用RT-PCR技术从甘蔗中克隆SoNADP-IDH，用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析，并用qRT-PCR技术研究SoNADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因，命名为SoNADP-IDH，GenBank登录号为KF808326。该cDNA全长1 497 bp，含有1个1 239 bp的完整开放阅读框（ORF），编码412个氨基酸。生物信息学分析表明，该蛋白为亲水蛋白，不含信号肽，为稳定蛋白，有跨膜区域，为可溶性蛋白，二级结构分析显示，含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲，并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明，SoNADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶（IDH）蛋白有很高的同源性，与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，SoNADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达，在甘蔗体内为组成型表达，在生物胁迫（RSD病菌）和4种非生物胁迫下低温（4℃）、干旱（PEG）、高盐（NaCl）和激素（ABA）均可影响SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达，且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下，SoNADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式，6 h表达量升到最高，之后又开始持续下降，在处理48 h时表达量降到最低；在4℃处理的低温胁迫下，3 h时，SoNADP-IDH的表达量降到最低，之后随着处理时间的延长，SoNADP-IDH的表达量增加，24 h升到最高点，48 h时，又有稍微下降；在ABA作用下，SoNADP-IDH表现出“抑-扬-抑-扬”的表达模式，在处理3 h时SoNADP-IDH表达量有所降低，6 h时升到最高，在处理24 h时降到最低，48 h又有所上升；在NaCl模拟的高盐胁迫下，SoNADP-IDH表现出“扬-抑-扬”的表达模式，SoNADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高，之后开始急剧下降，24 h时降到最低，之后开始有所上升，48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因，RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达水平，该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。

Cloning and Expression Analysis of Sugarcane NADP+-Dependent lsocitrate Dehydrogenase (SoNADP-IDH) Gene