首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
     检索      

猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响
引用本文:梁亚冰,张琪,常嵘,童德文,许信刚.猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响[J].中国农业科学,2015,48(2):352-361.
作者姓名:梁亚冰  张琪  常嵘  童德文  许信刚
作者单位:西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100
基金项目:西北农林科技大学基本科研业务费专项资金项目资助计划
摘    要:【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus ,TGEV)陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV 陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况,Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响,采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响,通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因,经过测序鉴定,3a基因的大小为213bp,3b基因的大小为732bp;经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析,3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%-100%,氨基酸同源性为98.6%-100%;3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%-99.9%,氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后,经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白,与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达,流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多,实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于对照组细胞(IEC和IEC-GFP),同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组,并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞,差异显著;TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示,表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的mRNA水平高于对照组, Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组,差异显著,说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调;TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达,3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应,3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。

关 键 词:猪传染性胃肠炎病毒  非结构蛋白3a  非结构蛋白3b  真核表达  细胞周期
收稿时间:2014-03-04

Fusion Expression of Non-Structural Proteins 3a and 3b of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Influence on Cell Cycle
LIANG Ya-bing,ZHANG Qi,CHANG Rong,TONG De-wen,XU Xin-gang.Fusion Expression of Non-Structural Proteins 3a and 3b of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Influence on Cell Cycle[J].Scientia Agricultura Sinica,2015,48(2):352-361.
Authors:LIANG Ya-bing  ZHANG Qi  CHANG Rong  TONG De-wen  XU Xin-gang
Institution:College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Shaanxi 712100, Yangling
Abstract:
Keywords:transmissible gastroenteritis virus  nsp 3a  nsp 3b  eukaryotic expression  cell cycle
本文献已被 CNKI 万方数据 等数据库收录!
点击此处可从《中国农业科学》浏览原始摘要信息
点击此处可从《中国农业科学》下载免费的PDF全文
设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号