猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响

【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ，TGEV）陕西分离株的3a和3b基因，研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV 陕西分离株克隆3a和3b基因，再将其与真核表达载体pEGFP-N1连接，构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells，IEC），采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况，Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响，采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响，通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因，经过测序鉴定，3a基因的大小为213bp，3b基因的大小为732bp；经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析，3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%-100%，氨基酸同源性为98.6%-100%；3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%-99.9%，氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后，经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白，与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达，流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多，实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于对照组细胞（IEC和IEC-GFP），同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组，并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞，差异显著；TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示，表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的mRNA水平高于对照组， Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组，差异显著，说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调；TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达，3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应，3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。

Fusion Expression of Non-Structural Proteins 3a and 3b of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Influence on Cell Cycle