| 摘 要： | 目的]基于人精液DNA试剂盒提取法,优化家畜冷冻精液DNA纯化方法,探讨冷冻精液中影响DNA提取质量的因素。方法]使用摩拉水牛冷冻精液,按100μL(或200μL)样品初始量,以及0.5、1、1.5、2、3和5 h的蛋白酶解时间,用试剂盒法纯化DNA。从DNA产物浓度、A_(260)/A_(280)和A_(260)/A_(230)值3方面,结合琼脂糖凝胶电泳和PCR检测进行分析,最终确定DNA纯化的最佳精液初始量以及最佳蛋白质酶解时间。在此基础上,纯化67份来源于牛、马、驴等不同家畜品种的冷冻精液DNA,同时测定每份精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖的含量,结合精液样品的冻存时间,研究以上4种因素对DNA纯化质量的影响。结果]使用100μL冷冻精液,蛋白酶解3 h的纯化效果最好,而且酶解2和3 h的DNA产物,均可以满足后续核基因组和线粒体基因组常规PCR的要求。家畜冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖含量与提取DNA浓度、A_(260)/A_(280)和A_(260)/A_(230)值(纯度)在不同程度上呈斯皮尔曼负相关,其中果糖是干扰DNA纯化的关键因素,同时样品的冻存时间与DNA质量存在显著正相关关系。虽然冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖等成分可以减轻冷冻复苏对精子的损伤,但这些成分的增加,会对DNA纯化质量产生一定的负面影响,即使它们随着冻存时间及DNA纯化时酶解时间的延长而有所消耗。结论]优化后的人精液DNA试剂盒法可完全适用于家畜冷冻精液DNA的纯化。
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