| 摘 要： | 酵母ATG6蛋白是磷脂酰基醇-3激酶(PI3K)复合物Ⅰ的组成成分,在自噬起始阶段促进自噬小体的形成。为研究弓形虫ATG6同源蛋白(Tg ATG6)生物学功能,本研究首先构建进化树对Tg ATG6基因进行同源性分析,并通过构建稳定表达红色荧光的(ATG6-m Cherry)虫株,以检测Tg ATG6的亚细胞定位情况。通过CRISPR/Cas9技术制备Tg ATG6基因缺失虫株,采用流式细胞术对该虫株的生长特性进行检测。实验结果显示,Tg ATG6基因在进化关系上与植物来源的ATG6同源关系较近。Tg ATG6在虫体内呈弥散分布,经16 h饥饿诱导后,该蛋白在弓形虫体内发生聚集。经序列分析显示,成功获得了两种Tg ATG6基因缺失虫株(ΔTg ATG6-1和ΔTg ATG6-2)。在ΔTg ATG6-2虫株中,Tg ATG6基因开放阅读框的593~612位点之间插入了226 bp外源序列,而在ΔTg ATG6-2中,不能够有效扩增靶序列,表明两种突变虫株的Tg ATG6基因均被有效插入失活。此外,该基因的缺失可能影响了虫株侵入宿主细胞的能力。Tg ATG6基因缺失株的成功制备为进一步研究Tg ATG6蛋白功能奠定了基础。
|
