内弯宫脂线虫环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测方法的建立

为建立内弯宫脂线虫(H.aduncum)的LAMP-LFD快速检测技术,本研究将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)的检测方法结合,以内弯宫脂线虫核糖体DNA(r DNA)的内转录间隔区(ITS)序列为检测靶标,设计了3对特异性引物(其中上游内引物由生物素标记)进行LAMP扩增反应,产物与经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针杂交,在LFD上完成结果显示。结果表明,LAMP-LFD方法能够特异性地检测内弯宫脂线虫,对简单异尖线虫等8种其它常见鱼类寄生蠕虫检测呈阴性。对含有内弯宫脂线虫r DNA-ITS2序列的重组质粒的检测灵敏度为1.4×10~2拷贝/μL,为常规PCR检测方法的100倍;对内弯宫脂线虫第三期幼虫,单虫检测灵敏度为单条虫体基因组DNA的10-6倍。优化后LAMP检测时程仅40 min。对实际样品的检测结果表明,LAMP-LFD方法检测内弯宫脂线虫与PCR结合测序方法获得的结果一致。因此,利用LAMP-LFD能够特异、灵敏、高效地检测出内弯宫脂线虫,具有在该线虫的检验检疫中良好的应用前景。