| 摘 要： | 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据"20N+NGG"原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1的mRNA水平(P0.05);Western Blot检测结果表明在阳性细胞中均未表达SCD1蛋白.【结论】获得两株敲除SCD1基因的GFFs,为制备敲除SCD1基因奶山羊核供体提供了生物材料.
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