| 马铃薯卷叶病毒PLRV RT-LAMP检测方法优化 |
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| 引用本文： | 高彦萍,张 武,王国祥,席春艳,吴雁斌,梁宏杰,吕和平. 马铃薯卷叶病毒PLRV RT-LAMP检测方法优化[J]. 植物保护, 2019, 45(6): 259-264 |
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| 作者姓名： | 高彦萍 张 武 王国祥 席春艳 吴雁斌 梁宏杰 吕和平 |
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| 作者单位： | 1. 甘肃省农业科学院马铃薯研究所, 兰州 730070; 2. 甘肃省农业科学院中药材研究所, 兰州 730070; 3. 甘肃省马铃薯脱毒种薯种苗病毒检测及安全评价工程技术研究中心, 兰州 730070 |
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| 基金项目： | 甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2016-15); 国家重点研发计划(2017YFD0201602-4, 2018YFD020080501); 甘肃省农业科学院院列项目(2019GAAS04, 2017GAAS29, 2017GAAS90) |
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| 摘 要： | 马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus(PLRV)是目前严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一,给马铃薯产业造成巨大损失。本研究采用环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立PLRV的RT-LAMP检测方法。采取单因素变化试验,对RT-LAMP反应体系中多个因素包括引物组合、温度条件及Mg~(2+)、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR GreenⅠ和引物组合的浓度进行一系列试验和优化。采用RT-PCR检测方法进行平行比对试验,对优化后的RT-LAMP反应体系进行了验证。结果表明,最佳引物组合为P3,最适反应温度62℃,25μL反应体系中,Mg~(2+)、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳终浓度分别为4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL,dNTPs的最佳用量为1μL(dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L,dUTP 1.2 mmol/L),SYBR GreenⅠ(20×)的最佳用量1μL,primer mix的最佳用量2.5μL(PLRV-FIP/BIP、PLRV-F3/B3和PLRV-LF/LB的浓度分别为0.8、0.2μmol/L和0.6μmol/L),RNA模板1μL(2 ng/μL),加DEPC-H_2O至25μL,反应时间50 min。优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR一致,且可视化判读结果。因此,建立的PLRV RT-LAMP检测方法为进一步开发RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用奠定了基础。
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| 关 键 词： | 马铃薯卷叶病毒(PLRV) 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 检测方法 |
| 收稿时间： | 2018-11-23 |
| 修稿时间： | 2019-02-17 |
Optimization of the PLRV RT-LAMP detection method |
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| Affiliation: | 1. Potato Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Chinese Herbal Medicines, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China; 3. Gansu Engineering Technology Research Center of Potato Seed Seedling Virus Detection and Evaluation, Lanzhou 730070, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Potato leafroll virus(PLRV) RT-LAMP reaction system |
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