家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息，明确其时空表达模式，结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响，探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆，得到其编码区核苷酸序列；应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析；利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析；构建原核表达载体p28-BmSP141，并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达，利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化；通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况；利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白，其中第1-17位氨基酸为信号肽，其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD，等电点为7.8。同源序列比对表明，BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高，分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体，与活性相关的基序也很保守，但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比，BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后，重组蛋白均以包涵体形式表达，经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白，并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明，该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加，但眠期表达下降，蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明，BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达，且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明，BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中，进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平，BmSP141饥饿处理后表达量显著下调，而重新喂食后其表达量上调，表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达，在幼虫期食桑期高表达，蛹期和成虫期表达水平较低，受消化道食物的诱导而上调表达，推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。

Characterization and Expression Analysis of Serine Protease BmSP141 from the Silkworm (Bombyx mori ) in Response to Starvation