猪cGAS基因的克隆与原核表达

【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶，能够识别胞质DNA，催化ATP和GTP生成第二信使cGAMP，继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3，启动机体固有免疫。通过构建含猪cGAS基因的重组质粒pBbB3a-His6-NusA-cGAS，进行原核表达，得到cGAS蛋白，为进行体外催化合成cGAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏cDNA为模板克隆猪cGAS的蛋白编码区 (open reading frame, ORF)，用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒，转化至E.coli BL21 (DE3)中。当细菌生长到对数期时，丙酸钠诱导表达His6-NusA-cGAS融合蛋白，用20 mmol·L^-1丙酸钠在20℃，180 r/min分别诱导0, 2, 4, 6, 8, 10 h，以确定最佳诱导时间；然后，分别用0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 mmol·L^-1的丙酸钠在20℃，180 r/min诱导6 h，以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度；另外，分别在20℃，30℃，37℃条件下用20 mmol·L^-1丙酸钠，180 r/min培养6 h，以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件，并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】（1）本试验成功克隆了猪cGAS基因，其ORF长度为1 494 bp；（2）构建了cGAS丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-cGAS；（3）His6-NusA-cGAS融合蛋白在37℃，添加20 mmol·L^-1丙酸钠，诱导6 h时表达量最高。（4）His6-NusA-cGAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达，相对分子质量为111.87 kD。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了cGAS融合蛋白，本试验为体外表达cGAS融合蛋白提供技术方法。

Cloning and Prokaryotic Expression of Porcine cGAS Gene