茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB克隆及表达分析

【目的】花色苷是一类通过类黄酮途径合成的水溶性次生代谢产物,既能使植物的不同器官呈现红、紫、蓝等颜色,还有利于人体健康。紫茄富含花色苷,但是有关茄萼花色苷生物合成的分子机制还不是很清楚。本研究旨在通过克隆茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB,测定其在不同发育时期不同颜色茄萼中的表达量,探究DFR和MYB在茄萼花色苷合成中的作用。【方法】选用绿萼和紫萼长茄(Solanum melongena L.)果萼为试材,测定不同p H条件下茄萼花色苷含量;通过RACE方法分离克隆DFR和MYB cDNA全长序列,分析DFR和MYB的保守结构域及序列特征;分别对DFR和MYB及其同源蛋白序列进行系统进化分析,构建系统进化树来进一步分析鉴定基因;使用Ex PASy网站提供的在线分析软件SOPMA预测蛋白质二级结构;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在不同发育阶段果萼中的表达情况。【结果】从绿萼和紫萼长茄果萼中克隆了DFR和MYB片段,分别命名为ouSmDFR、dongSmDFR和ouSmMYB、dongSmMYB,Gen Bank登录号分别为:KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。ouSmDFR和dongSmDFR全长分别为1 285 bp和1 249 bp,开放阅读框为858 bp和864 bp,分别编码285个和287个氨基酸;ouSmMYB和dongSmMYB全长分别为969 bp和959 bp,开放阅读框均为462 bp,编码153个氨基酸。蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲均为两个DFR蛋白和两个MYB蛋白的主要二级结构元件。序列比对表明DFR蛋白具有NADPH结构域(NADPH binding domain)和底物特异性结合结构域(Substrate specific binding domain),属于NADB-Rossmann超基因家族;MYB蛋白属于R2R3-MYB转录因子,具有R2、R3两个MYB结构域和b HLH结合域。ouSmDFR和dongSmDFR与St DFR和Sl DFR具有相对较高的同源性;ouSmMYB和dongSmMYB与Es MYB同源性较高。花色苷含量测定显示,紫萼果茄萼花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加;而绿萼茄萼几乎检测不到花色苷。荧光实时定量PCR分析表明,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达量均远高于绿萼长茄;从初蕾期到盛花期,紫萼长茄果萼中DFR和MYB表达量逐渐升高,而绿萼长茄则几乎没有变化,与两个品种茄萼颜色变化相一致。【结论】ouSmDFR和dongSmDFR属于NADB-Rossmann超基因家族,ouSmMYB和dongSmMYB为典型R2R3-MYB转录因子,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄。推测DFR和MYB在茄萼呈色中发挥作用,并且参与花色苷生物合成。

Cloning and Expression Analysis of Anthocyanin Biosynthesis-Associated DFR and MYB Genes in Calyx of Eggplant (Solanum melongena L.)