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结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度
引用本文:施松梅,高启国,廉小平,毕云龙,刘晓欢,蒲全明,刘贵喜,柳菁.结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度[J].中国农业科学,2016,49(1):14-26.
作者姓名:施松梅  高启国  廉小平  毕云龙  刘晓欢  蒲全明  刘贵喜  柳菁
作者单位:1西南大学农学部,重庆 400715 2重庆市蔬菜学重点实验室,重庆 400715
基金项目:国家“973”计划(2012CB113900)、国家自然科学基金(31572127,30900986,30971849)、中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2010B010)、重庆市自然科学基金重点项目(cstc2012jjB80010)
摘    要:【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRKARC1Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1-SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1-Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至pGADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1-ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体pGBKT7(BD)质粒。用PEG/LiAc法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/ X-a-gal/25 mM 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 mM 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3ADE2MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 mM 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3ADE2MEL1。随着ARC1或Exo70A1 截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和 Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfamExo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。

关 键 词:结球甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitataL.)  自交不亲和  SRK  ARC1  Exo70A1  酵母双杂交  截短体  
收稿时间:2015-07-13

Identification of Interaction Domain of SRK-ARC1-Exo70A1 and Interaction Strength Analysis in Brassica oleracea var. capitata L.
SHI Song-mei,GAO Qi-guo,LIAN Xiao-ping,BI Yun-long,LIU Xiao-huan,PU Quan-ming,LIU Gui-xi,LIU Jing,REN Xue-song,YANG Xiao-hong,ZHU Li-quan,WANG Xiao-jia.Identification of Interaction Domain of SRK-ARC1-Exo70A1 and Interaction Strength Analysis in Brassica oleracea var. capitata L.[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(1):14-26.
Authors:SHI Song-mei  GAO Qi-guo  LIAN Xiao-ping  BI Yun-long  LIU Xiao-huan  PU Quan-ming  LIU Gui-xi  LIU Jing  REN Xue-song  YANG Xiao-hong  ZHU Li-quan  WANG Xiao-jia
Institution:1Faculty of Agriculture, Southwest University, Chongqing 400715 2Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Chongqing 400715
Abstract:
Keywords:   Brassica oleracea var  capitata L    self-incompatible  SRK  ARC1  Exo70A1  yeast two-hybrid  truncation
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