| 海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析 |
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| 引用本文： | 李亚东,汪康游,樊帅,杨兆勇,田喜凤,许乐幸,金媛媛.海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析[J].农业生物技术学报,2016(5):729-737. |
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| 作者姓名： | 李亚东 汪康游 樊帅 杨兆勇 田喜凤 许乐幸 金媛媛 |
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| 作者单位： | 1. 华北理工大学基础医学院,唐山063000;中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所/卫生部抗生素生物工程重点实验室,北京100050;2. 中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所/卫生部抗生素生物工程重点实验室,北京,100050;3. 华北理工大学基础医学院,唐山,063000;4. 浙江医药高等专科学校,宁波,315000 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金面上项目(No.81172965)、中央级公益性科研院所基本科研业务专项(No.IMBF201509)、浙江省宁波市自然基金项目(No.2015A610287)、协和青年科研基金(No.3332015166)和国家科技重大专项(No.2014ZX09201-003-002和No.2015ZX09102007-016) |
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| 摘 要： | 为获取全新来源并具有潜在高性能的海因酶,本研究通过对海洋沉积物进行以D-对羟基苯海因作为唯一氮源的选择培养基对潜在菌株进行初步筛选,然后通过双层琼脂法和微孔快速筛选法对初筛菌株进行复筛,并结合分子生物学筛选方法进行终筛,最终得到桔橙小单胞菌(Micromonospora aurantiaca,GenBank登录号:FJ547135.1)、金色链霉菌(Streptomnyces aureofaciens,GenBank登录号:AB326923.1)、桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii,GenBank登录号:GU238264.1)和链霉菌7-145(Streptomyces sp.7-145,GenBank登录号:JQ782979.2)4株产D-海因酶的阳性链霉菌.用兼并引物扩增4株阳性菌中的D-海因酶表达序列,转化大肠杆菌(Escherichia coli),并构建表达相应D-海因酶的工程菌株E.coli S1、E.coli S14、E.coli S29和E.coliS 145,提纯4种D-海因酶,并测定酶的酶活和动力学参数.结果显示,链霉菌7-145菌株中表达的海因酶活性最高,比活力为9.7 U/mg,催化速度常数Kcat=3.2x106/s,Km=9.5 mmol/L.最后利用Swiss-model软件对其进行在线同源模建和Caver Analyst软件对链霉菌7-145菌株来源的海因酶的催化通道进行结构模拟分析.模拟分析结果显示,本研究中D-海因酶的主要催化通道Tunnel 1长度为9.1(A),瓶颈氨基酸残基为59位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18 (A);潜在的催化通道Tunnel 2长度为13.6(A),瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52(A).如果对Tunnel 2通道中的62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸进行定点突变,有望开发出一种性能更优的D-海因酶.本研究提供了一种全新的海因酶阳性菌筛选体系,通过计算机模拟手段能够更直观了解海因酶的催化机制,为进一步获得性能更优的海因酶奠定基础.
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| 关 键 词： | D-海因酶 D-对羟基苯甘氨酸 D-对羟基苯海因 海洋链霉菌 Caver Analyst |
Isolation of Strain Producing D-hydantoinase from Marine and Its Simulation Analysis of the Enzyme Catalytic Channel |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | D-hydantoinase D-phydroxyphenylglycine D-phydroxyphenylhydantion Marine Streptomyces Caver Analyst |
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