BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。