MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能，特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料，设置正常供磷（+Pi，MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi，MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后，观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异，通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式，应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用，且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间，从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高，在LA1996中的表达最低。相反，miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高，在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反，证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下，野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低，但在花芽、花和绿果中相对较高；miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%，花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下，野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达；转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄；转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅；转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株；miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中，miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低，但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下，miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型，表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达，进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。

Negative Regulation of Anthocyanin Biosynthesis in Tomato by MicroRNA828 Under Phosphate Deficiency