亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析

【目的】microRNA （miRNA）作为一类内源性的非编码RNA，仅有18-25 nt，其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象，对miR-451及其靶基因（巨噬细胞游走因子， MIF）在相互作用关系进行分析。【方法】参考miR-451成熟体序列（AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU）来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物，RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列；并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的dsRNA序列，用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因（登录号：AF289543.2），设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物，以β-actin作为内参基因，采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射dsRNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平，以及miR-451的表达谱特征。【结果】琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致，为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性，特别是种子序列极度保守，仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实，0-30 h miR-451表达逐渐上调，6 h达到最高值，其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调，42 h达到峰值（拷贝量仅为9.0×103），此后其表达规模受到抑制，48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调，直到90 h达到峰值，并呈现正态分布趋势。【结论】利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列，生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性，因此，以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能，是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因，其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测qPCR及RNA干扰分析表明，miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时，MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象，且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明，miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。

Dynamic Analysis of Expression Level of miR-451 and MIF Gene in Different Developmental Stages of Adult Hyalomma asiaticum