棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析

【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板，克隆海岛棉（Gossypium barbadense L.）GbU6启动子，筛选出能在棉花生殖细胞中（花粉）高效转录的GbU6启动子，为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的GbU6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列，利用Primer 5.0软件设计5对引物，进行第一轮能覆盖完整GbU6启动子的PCR扩增，产物克隆测序正确后，再利用transfer PCR法将GbU6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中；第二轮扩增产物测序正确后，运用DNAMAN软件对克隆成功的5个GbU6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析；然后以pBI101质粒DNA为模板，PCR扩增并克隆GUS报告基因，经酶切鉴定、测序正确后，用BbsⅠ酶切GUS，连入经同样酶切后的5个GbU6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中，转化、酶切鉴定，获得对应的5种GbU6::GUS的表达载体。将含有CaMV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照，以上述6种表达载体DNA为模板，采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段，利用基因枪轰击法将5种GbU6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉，并进行GUS染色，最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次，最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的GbU6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种GbU6启动子，启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp，并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体；对拟南芥和克隆的5个GbU6启动子序列进行序列比对，结果表明，GbU6启动子区与拟南芥U6启动子一样，也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框，而且这两个元件之间的距离也非常固定；用GbU6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉，发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个GbU6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达，棉花花粉被染成蓝色。其中GbU6-5P::GUS的染色相对较深，接近于CaMV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的GbU6启动子，为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。