小麦条锈菌III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1）的功能分析

【目的】克隆小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1），分析其在小麦条锈菌生长发育与致病过程中的作用。【方法】利用RT-PCR技术克隆PsPik1的cDNA序列，采用生物信息学技术分析该基因编码蛋白分子特征并构建进化树；运用实时荧光定量PCR技术，选用小麦条锈菌的延伸因子（elongation factor，EF）作为内参，明确该基因在小麦条锈菌夏孢子阶段和侵染小麦后6、12、18、24、36、48 h以及3、5、7、9、11 d共12个发育时期的表达特征；利用病毒介导的基因沉默技术（BSMV-host-induced gene silencing，BSMV-HIGS），分析沉默PsPik1后对小麦条锈菌生长发育及致病性的影响。通过传统酶切连接的方法构建重组载体BSMV:γ:PsPik1-as，利用体外转录技术获得BSMV α、β与γ3个组分，在小麦二叶一心期接种BSMV: γ:PsPik1-as、BSMV: γ:0-as与BSMV: γ:TaPDS-as。接种病毒后第10天，在小麦第4叶接种条锈菌CYR32，接菌后24、48、120 h分别取样，以检测PsPik1的沉默效率和进行组织学观察。样品经染色处理后，统计分析接菌后48 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌丝分支数、吸器母细胞数与菌丝长度的差异，及120 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌落面积的差异。在接菌后12 d观察条锈病发病情况并照相记录。【结果】PsPik1开放阅读框（open reading frame，ORF）全长4 485 bp，编码1 494个氨基酸，具有III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶典型的脂激酶特有结构域（LKU）、钙神经传感蛋白（NCS1）结合位点、Hom2结构域和PI3K/PI4K超家族激酶结构域。聚类分析表明，PsPik1聚于PI4KIIIβ类群，PsPik1与柄锈菌属的Pik1亲缘关系较近，与子囊菌Pik1亲缘关系次之，而与动物及植物的PI4KIIIβ亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果表明，PsPik1在接种后6、12、18、24 h呈诱导上调表达趋势，分别为夏孢子时期表达量的2.66、7.04、3.42、2.96倍，其中在12 h其表达水平最高。接种后36 h至5 d，PsPik1的表达水平开始下降，一直低于夏孢子表达水平，分别为夏孢子表达量的60%、30%、16%、15%。接种后7-11 d，PsPik1的表达量开始升高，在接种后11 d恢复至与夏孢子相当的水平。PsPik1基因沉默后的组织学观察分析表明，与接种BSMV:γ:0-as（对照）相比，接种BSMV:γ:PsPik1-as植株中条锈菌组织分化与生长发育受到了不同程度的影响，表现在接菌后48 h菌丝长度和分支数目明显减小，接菌后120 h菌落面积明显减小。沉默效率检测结果显示，在接菌后24、48、120 h，接种BSMV:γ:PsPik1-as植株PsPik1的表达水平分别仅为对照植物的49%、49%、69%，表明PsPik1的表达明显地受到抑制。【结论】PsPik1可能参与了病菌侵染初期的侵染结构分化及寄生关系的建立，在条锈菌致病过程中发挥重要作用。

Functional Analysis of PsPik1 Encoding Type III Phosphatidylinositol 4-kinase in Puccinia striiformis f. sp. tritici